莲心碱通过上调eNOS和Nrf2/HO-1信号通路在体外改善血管内皮氧化损伤

《Food Science & Nutrition》：Liensinine Ameliorating Oxidative Damage to Vascular Endothelium In Vitro via Upregulating eNOS and Nrf2/HO-1 Signaling

　　

莲心碱（Liensinine）作为莲子心（Plumula nelumbinis）的主要生物碱，对血管相关疾病，特别是血管内皮氧化损伤（ODVE）具有显著作用。然而，其潜在机制尚不明确。本研究利用网络药理学、分子对接及分子动力学模拟分析了莲心碱抗ODVE的靶点、结合能及蛋白-配体复合物的稳定性，并通过保护H₂O₂损伤的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行验证，检测了细胞活力、迁移、凋亡、活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）含量、核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）、血红素加氧酶1（HO-1）、超氧化物歧化酶2（SOD2）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）及磷酸化eNOS（p-eNOS）的表达，以及Nrf2的定位。研究人员使用硝普钠（SNP）、L-NAME和ML385分别作为NO供体、eNOS抑制剂和Nrf2抑制剂，验证莲心碱调控Nrf2/HO-1通路和eNOS活性的作用。韦恩分析（Venn analysis）确定了莲心碱与ODVE之间的77个共同靶点。根据蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析和分子对接结果，莲心碱对NFKB1、NFE2L2和ESR1具有强亲和力。分子动力学模拟结果表明，NFE2L2–莲心碱复合物最为稳定。基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析表明，NO生成和氧化应激是保护作用涉及的主要机制。在体外验证实验中，莲心碱对ODVE表现出强保护作用，包括增强细胞活性、迁移和NO生成，减少ROS产生和细胞凋亡。其潜在机制可能与上调eNOS和Nrf2/HO-1通路有关，甚至可能涉及交叉调控。这些发现表明，莲心碱有潜力作为因氧化应激导致血管内皮损伤患者的膳食补充剂。

**研究背景、现存问题与研究目的**
血管内皮细胞是血管系统的重要组成部分，不仅维持血液循环，还通过释放活性因子调控生理功能。衰老、炎症反应、糖脂代谢异常及氧化应激均可导致血管内皮功能障碍，其中氧化应激起核心作用。若血管内皮氧化损伤（ODVE）未及时逆转，会引发微血管功能障碍，导致一氧化氮（NO）生成减少、抗黏附及抗凝等功能改变，进而诱导活性氧（ROS）产生、抗氧化能力下降、膜去极化及细胞凋亡。目前临床常用的抗血小板、降脂、降压及抗炎药物虽能部分改善血管功能，但直接保护内皮细胞免受氧化应激损伤的策略仍不足。因此，寻找有效缓解血管氧化应激损伤的治疗剂具有重要意义。莲子心（Plumula nelumbinis）作为传统中药和功能性食品，其生物碱成分莲心碱（liensinine）具有抗氧化、保护心肌、减轻脑和肝损伤及改善高血压诱导的血管重塑等活性，但其能否缓解ODVE、抑制内皮细胞凋亡并恢复其功能尚不清楚。
**研究内容与结论**
本研究采用网络药理学策略预测莲心碱缓解ODVE的关键靶点，通过分子对接和分子动力学模拟评估莲心碱与蛋白的结合亲和力及稳定性，最后利用H₂O₂诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）氧化损伤模型进行实验验证。结果表明，莲心碱显著增强细胞活力、迁移和NO生成，减少ROS产生和细胞凋亡；其机制与上调eNOS和Nrf2/HO-1信号通路有关，且两条通路间存在交叉调控。该研究揭示了莲心碱作为膳食补充剂用于氧化应激所致血管内皮损伤患者的潜力。论文发表在《Food Science》。
**关键技术方法（不超过250字）**
主要技术方法包括：1）网络药理学：通过SwissTargetPrediction等数据库收集莲心碱靶点（244个），从OMIM和Genecards数据库获取ODVE相关靶点（1294个），进行韦恩分析得到77个共同靶点；利用STRING平台进行蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析，通过CytoHubba和Centiscape插件筛选核心靶点；使用Metascape进行GO和KEGG富集分析。2）分子对接：采用Autodock vina 1.2.3评估莲心碱与6个核心靶点（NFKB1、NFE2L2、ESR1、SRC、MMP9、CCND1）的结合能。3）分子动力学模拟：使用GROMACS 2023.2对NFKB1–、NFE2L2–、ESR1–莲心碱复合物进行100 ns模拟，分析RMSD、RMSF、Rg、氢键数及自由能景观。4）体外实验：以200 μM H₂O₂处理HUVECs（来源：南京赛鸿瑞生物科技有限公司）建立氧化损伤模型，检测细胞活力（CCK-8）、迁移（划痕实验）、凋亡（calcein-AM/PI染色）、ROS（荧光探针）、NO（试剂盒）、蛋白表达（Western blot）及Nrf2核转位（免疫荧光）。
**研究结果**
**3.1 靶点收集**：通过韦恩分析获得莲心碱与ODVE的77个共同靶点，构建药物-靶点-疾病网络。
**3.2 网络构建与PPI分析**：PPI网络显示核心靶点按连接度排序前6位为NFKB1、NFE2L2、ESR1、SRC、MMP9、CCND1。
**3.3 GO与KEGG富集分析**：GO分析显示生物过程涉及NO的细胞响应、缺氧响应等；KEGG分析显示主要通路包括流体剪切应力与动脉粥样硬化通路、化学致癌-活性氧通路等，关键基因为NFE2L2、HMOX1、NOS3（分别编码Nrf2、HO-1、eNOS）。
**3.4 分子对接**：莲心碱与6个蛋白均显示良好亲和力，其中与NFKB1、NFE2L2、ESR1结合能低于-7.0 kcal/mol，呈现出强亲和力。
**3.5 分子动力学模拟**：NFE2L2–莲心碱复合物在100 ns模拟中RMSD、RMSF、Rg更稳定，氢键结合更持久，自由能景观显示最低能量构象，表明该复合物最稳定。
**3.6 EC50计算与细胞活性**：莲心碱促HUVECs增殖的EC50为906.1 nM；0.1、1.0、5.0 μM莲心碱剂量依赖性地恢复H₂O₂损伤后的细胞活性。
**3.7 迁移与凋亡**：划痕实验表明1.0和5.0 μM莲心碱显著增强细胞迁移（p<0.01）；calcein-AM/PI染色显示三个浓度均提高细胞存活率，减少凋亡。
**3.8 ROS与NO含量**：莲心碱剂量依赖性地降低细胞内ROS水平（p<0.05/0.01），高浓度（5.0 μM）显著恢复NO生成（p<0.05）。
**3.9 Nrf2/HO-1与eNOS激活**：Western blot显示H₂O₂处理后Nrf2、HO-1、SOD2、p-eNOS及p-eNOS/t-eNOS比值下降，莲心碱（5.0 μM）显著上调这些蛋白；L-NAME（eNOS抑制剂）不仅降低p-eNOS，还下调Nrf2、HO-1、SOD2；ML385（Nrf2抑制剂）不仅降低Nrf2、HO-1，还减少eNOS磷酸化和SOD2，提示交叉调控。
**3.10 Nrf2核转位**：免疫荧光显示模型组Nrf2主要位于胞质，莲心碱促进Nrf2核转位（p<0.01）；SNP增强此效应，L-NAME和ML385则抵消。
**3.11 交叉验证**：L-NAME抵消莲心碱的ROS清除作用（p<0.05），ML385抵消其NO生成作用（p<0.05），进一步证实Nrf2/HO-1与eNOS间的交叉调控。
**讨论与结论总结**
讨论部分指出，氧化应激在多种病理过程中损害血管内皮细胞，NO生物利用度下降是内皮功能障碍的关键。莲心碱作为莲子中含量丰富的酚类生物碱，其化学结构（含有酚羟基）可能赋予其抗氧化活性。网络药理学预测的NFE2L2（即Nrf2）通路得到体外实验验证。EC50约为1 μM，选择5.0 μM进行机制研究。实验证明莲心碱通过激活Nrf2/HO-1通路和eNOS磷酸化，减少ROS、增加NO，保护细胞迁移与存活。L-NAME抑制eNOS后降低Nrf2表达，ML385抑制Nrf2后降低eNOS磷酸化，表明两条通路存在交叉调控，可能通过NO介导的Keap1 S-亚硝基化或Nrf2对eNOS的转录调控实现。莲心碱多效性、低毒性及减毒特性提示其作为膳食补充剂的潜力。
**结论部分翻译**：本研究通过生物信息学分析预测，莲心碱作为莲子心的主要生物碱，可通过调控NFKB1、NFE2L2、ESR1、SRC、MMP9和CCND1靶点改善ODVE。在构建H₂O₂诱导的ODVE体外模型后，莲心碱展现出明显的保护作用，包括增强细胞活性、迁移和NO生成，减少ROS产生和细胞凋亡。其潜在机制可能与上调Nrf2/HO-1和eNOS信号通路有关，甚至存在交叉调控。考虑到H₂O₂损伤模型的局限性，应使用其他体外模型（如氧糖剥夺/再复氧）及体内实验进一步探索莲心碱对人血管内皮细胞的保护作用。