清心莲子饮通过靶向TLR4/HIF-1α通路改善慢性肾病中的铁死亡

《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Qingxin Lianzi Yin Improves Chronic Kidney Disease by Targeting Ferroptosis via the TLR4/HIF-1α Pathway

　　

背景：铁死亡参与慢性肾脏病（CKD）的发病机制。清心莲子饮（QXLZY）在CKD治疗中显示出显著优势。本研究旨在探讨QXLZY对CKD中铁死亡的影响。方法：研究人员通过5/6肾切除术诱导的大鼠模型和TGF-β1刺激的HK-2细胞评估QXLZY的抗CKD效果。使用商业试剂盒和蛋白质印迹法评估氧化应激和铁死亡水平。通过网络药理学预测QXLZY治疗CKD的机制。通过蛋白质印迹法检测TLR4和HIF-1α水平。利用铁死亡诱导剂erastin探讨铁死亡在QXLZY治疗CKD中的作用。对过表达TLR4的HK-2细胞使用HIF-1α抑制剂LW6以研究其潜在机制。验证了通过网络药理学鉴定出的可能与TLR4相互作用的QXLZY成分。结果：QXLZY有效减轻了肾损伤，并抑制了CKD模型中的纤维化和炎症。此外，QXLZY显著抑制了氧化应激和铁死亡。然而，erastin部分抵消了QXLZY的抗CKD效果。TLR4和HIF-1α被确定为QXLZY调节CKD中铁死亡的潜在靶点。它们在CKD模型中显著升高，但在QXLZY治疗后降低。过表达TLR4逆转了QXLZY的抗CKD效果，而此现象被LW6改变。月桂酸（LA）和辛酸（CA）是QXLZY中调节CKD中TLR4/HIF-1α通路的生物活性成分。结论：QXLZY通过下调TLR4/HIF-1α通路抑制铁死亡，从而减轻肾纤维化并改善CKD，其中LA和CA可能发挥重要作用。

以下是对论文《清心莲子饮通过靶向TLR4/HIF-1α通路改善慢性肾病中的铁死亡》（发表于《MEDIATORS OF INFLAMMATION》）的学术解读。

**研究背景**
慢性肾脏病（CKD，chronic kidney disease）是全球性健康问题，约10%的成人受其影响，但目前基于RAAS阻断、他汀治疗、饮食调整及血压血糖控制等疗法难以逆转肾损伤并阻止疾病进展。铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，以铁过载和脂质过氧化为特征，在CKD患者肾脏中铁沉积增加并诱导铁死亡，加重肾损伤。靶向铁死亡可能成为CKD治疗的新策略。清心莲子饮（QXLZY）是传统中药经典方剂，临床研究显示其可降低24小时蛋白尿并改善IgA肾病症状，并在糖尿病肾病中通过调节糖脂代谢、氧化应激和炎症发挥疗效。但QXLZY是否通过调控铁死亡改善CKD及其具体机制尚不清楚。TLR4作为模式识别受体，在肾纤维化中促进炎症和纤维化，并可通过上调HIF-1α（hypoxia-inducible factor 1α，缺氧诱导因子1α）参与病理过程，因此TLR4/HIF-1α通路可能是QXLZY的作用靶点。本研究旨在评估QXLZY对CKD症状和铁死亡的影响，通过网络药理学预测其调节铁死亡的机制，并验证关键靶点和生物活性成分的作用。

**关键技术方法**
研究人员采用网络药理学方法，从TCMSP数据库筛选QXLZY活性成分及靶点，从GeneCards、DisGeNET、OMIM数据库获取CKD靶点，从FerrDb V2数据库获取铁死亡相关基因，取交集后构建蛋白互作网络并进行GO和KEGG富集分析。利用GEO数据库中GSE66494数据集（含53例CKD患者和8例正常样本）进行差异表达分析。通过CB-Dock2进行分子对接。体内实验采用5/6肾切除术构建CKD大鼠模型（Sprague–Dawley雄性大鼠），给予QXLZY低、高剂量（7.2、14.4 g/kg）或阳性对照KA（compound α-ketoacid，复方α-酮酸，1.2 g/kg）灌胃8周。体外实验使用TGF-β1刺激的人肾近端小管上皮细胞系HK-2。检测指标包括生化参数、HE及Masson染色、免疫组化、ELISA、Western blot、CCK-8等。

**研究结果**

**3.1 鉴定QXLZY调节CKD铁死亡的核心通路和靶点**
通过网络药理学筛选，获得QXLZY 356个活性成分和743个潜在靶点，CKD靶点361个，铁死亡相关基因集，三者交集得到12个重叠基因（IL6, IFNG, HNF4A, HMOX1, HIF1A, ESR1, EGFR, CXCL8, COL18A1, TLR4, TGFB1, NFE2L2）。KEGG富集分析显示这些基因主要富集于HIF-1通路。基于GSE66494数据集，CKD患者中EGFR、HIF1A、TLR4、IFNG表达上调，VEGFA下调。分子对接及HPLC-MS鉴定显示，月桂酸（LA, lauric acid）、辛酸（CA, caprylic acid）、十一烷酸（UDA, undecanoic acid）和棕榈酸（PA, palmitic acid）可与TLR4稳定结合，并在QXLZY中检出。

**3.2 QXLZY减轻CKD大鼠肾损伤和纤维化**
与假手术组相比，CKD大鼠尿白蛋白（UAlb）、血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）显著升高，HE染色显示肾小球损伤和肾小管上皮细胞萎缩，Masson染色显示胶原沉积增加，Collagen I、α-SMA表达升高，TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高。QXLZY和KA均逆转上述指标，减轻肾损伤和纤维化。

**3.3 QXLZY抑制CKD大鼠铁死亡并降低TLR4和HIF-1α表达**
CKD大鼠肾组织Fe²⁺、MDA水平升高，SOD降低，GPX4蛋白降低，ACSL4升高。QXLZY高剂量和KA逆转这些变化。TLR4和HIF-1α蛋白在CKD组升高，QXLZY下调其表达。

**3.4 QXLZY抑制TGF-β1处理的HK-2细胞纤维化和铁死亡并降低TLR4和HIF-1α表达**
TGF-β1刺激后HK-2细胞活力下降，Collagen I、α-SMA、TNF-α、IL-6、IL-1β升高，Fe²⁺、MDA升高，SOD降低，GPX4降低，ACSL4升高，TLR4和HIF-1α升高。QXLZY（20%）部分恢复细胞活力并逆转上述指标。

**3.5 QXLZY通过抑制铁死亡减轻TGF-β1处理的HK-2细胞纤维化和炎症**
铁死亡诱导剂erastin预处理部分抵消了QXLZY对细胞活力、GPX4、SOD、Fe²⁺、MDA、ACSL4以及炎症因子和纤维化标志物的调节作用，表明QXLZY的抗纤维化和抗炎作用依赖于抑制铁死亡。

**3.6 QXLZY通过抑制TLR4/HIF-1α通路抑制体外CKD中铁死亡**
过表达TLR4后，HIF-1α表达升高，QXLZY对细胞活力、纤维化、炎症、铁死亡指标的改善作用被逆转。使用HIF-1α抑制剂LW6后，TLR4过表达引起的效应被部分抵消，表明QXLZY通过TLR4/HIF-1α通路抑制铁死亡。

**3.7 LA和CA是QXLZY中调节CKD中TLR4/HIF-1α通路的生物活性成分**
在TGF-β1刺激的HK-2细胞中，LA和CA（而非UDA或PA）部分恢复细胞活力并降低TLR4和HIF-1α表达。过表达TLR4部分逆转了LA和CA对TLR4和HIF-1α的抑制作用。

**讨论与结论**
讨论部分指出，CKD病理机制与肾上皮细胞丢失及铁死亡相关，本研究证实QXLZY通过抑制铁死亡减轻肾纤维化。网络药理学和实验验证表明，QXLZY通过TLR4/HIF-1α通路发挥抗铁死亡作用，其中LA和CA是主要活性成分，可与TLR4结合并调节其下游信号。研究局限性包括未进行体内功能获得实验、PA的细胞毒性限制了其在TLR4/HIF-1α通路中的评估，以及结果需临床验证。

研究结论总结（翻译如下）：

总体来说，研究人员的发现表明，CKD与TLR4/HIF-1α通路的激活相关，该通路部分通过调节铁死亡促进肾小管损伤和纤维化。QXLZY通过抑制TLR4/HIF-1α通路发挥肾脏保护作用，从而抑制铁死亡并进而减轻肾纤维化。在QXLZY的成分中，LA和CA可能是产生这些效应的关键生物活性成分。