绞股蓝提取物在对抗H2O2诱导的氧化应激及预防白发中的作用

《Dermatology Research and Practice》：The Role of Gynostemma pentaphyllum Extract in Combating H2O2-Induced Oxidative Stress and Preventing Hair Graying

　　

**目的**：白发常与衰老（氧化应激）相关，因其社会影响和人们对年轻外貌的渴望而受到广泛关注。目前尚无有效解决方案。本研究旨在确定绞股蓝（*Gynostemma pentaphyllum* (Thunb.) Makino）提取物（GP）能否减轻H₂O₂诱导的黑素细胞氧化应激效应，并评估其作为白发治疗药物的潜力。

**方法**：使用B16黑色素瘤细胞和C57BL/6小鼠建立氧化应激模型。评估了GP处理对细胞活力、黑素细胞凋亡、细胞内活性氧（ROS）水平、黑色素生成、酪氨酸酶活性、总超氧化物歧化酶（SOD）活性以及Wnt/β-catenin信号通路的效应。在动物实验中，评估了GP对小鼠毛囊的保护作用。

**结果**：GP处理增强了细胞活力，降低了黑素细胞凋亡，减少了细胞内ROS水平，增加了黑色素生成，提高了酪氨酸酶和SOD活性，并可能调控了Wnt/β-catenin信号通路。在动物实验中，GP显著保护了小鼠毛囊免受H₂O₂诱导的损伤。

**结论**：研究结果表明，GP通过减轻H₂O₂诱导的黑素细胞氧化应激，具有治疗白发的潜力，凸显了其在应对氧化应激相关白发中的治疗前景。

**论文解读：绞股蓝提取物对抗氧化应激诱导白发的作用机制研究**

**一、研究背景与问题**

白发是衰老过程中的常见现象，其出现不仅影响个人外观，还常与社交压力和心理负担相关。目前，尽管染发剂和草药疗法被广泛使用，但缺乏科学证据支持其有效性和安全性。白发的核心在于毛囊黑素细胞的功能障碍。黑素细胞位于毛囊球部，通过酪氨酸酶等酶催化合成黑色素，并转移至邻近角质形成细胞，赋予毛发颜色。然而，随着年龄增长，活性氧（ROS）如过氧化氢（H₂O₂）的积累导致氧化应激，抑制黑素细胞增殖和黑色素生成，是驱动白发产生的关键因素。绞股蓝（*Gynostemma pentaphyllum* (Thunb.) Makino，简称GP）作为传统中草药，具有抗氧化、抗炎等生物活性，但其对氧化应激诱导白发的保护作用及分子机制尚未得到系统研究。本研究旨在探讨GP提取物是否能够通过缓解H₂O₂诱导的氧化应激，发挥抗白发效应，为开发天然白发防治药物提供依据。论文发表于《Dermatology Research and Practice》。

**二、关键技术与方法**

研究采用体外和体内两种模型。体外模型使用B16小鼠黑色素瘤细胞（购自ATCC标准来源，但文中未明确列出细胞系来源，仅注明培养条件），通过1.5 mM H₂O₂处理30分钟建立氧化应激模型。体内模型选用4周龄雄性C57BL/6小鼠（购自SCBS Biotechnology Co., Ltd.，河南），背部剃毛后局部涂抹3% H₂O₂诱导白发。主要技术方法包括：CCK-8法检测细胞活力；NaOH裂解法测定黑色素含量；L-酪氨酸底物法检测酪氨酸酶活性；WST-1法检测总超氧化物歧化酶（SOD）活性；DCFH-DA探针结合流式细胞术检测细胞内ROS水平；实时定量PCR（qRT-PCR）检测黑色素合成相关基因MITF（小眼畸形相关转录因子）、TYR（酪氨酸酶）、TYRP1（酪氨酸酶相关蛋白1）和β-catenin的mRNA表达；苏木精-伊红（HE）染色观察小鼠毛囊长度；并通过摄影记录毛发颜色变化。所有动物实验经安徽师范大学学术伦理委员会批准。

**三、研究结果**

**3.1 GP保护B16细胞抵抗H₂O₂诱导的细胞毒性和凋亡**
通过CCK-8实验发现，H₂O₂处理显著增加B16细胞凋亡比例，而GP（0.02%–0.16%）预处理可显著减轻H₂O₂的细胞毒性，且GP单独处理不影响细胞活力。表明GP具有保护黑素细胞免受氧化应激损伤的能力。

**3.2 GP对H₂O₂诱导氧化应激下B16细胞黑色素含量的影响**
NaOH法测定显示，H₂O₂处理使黑色素含量降至对照组的90.32%，而GP（0.02%–0.16%）处理48小时后，黑色素含量呈剂量依赖性回升，0.16% GP组达到110.62%（p<0.05），效果优于阳性对照IBMX（98.60%）。证实GP可逆转H₂O₂导致的黑色素减少。

**3.3 GP对H₂O₂诱导氧化应激下B16细胞酪氨酸酶和SOD活性的影响**
酪氨酸酶活性测定显示，H₂O₂组酶活性降至对照的90.06%，GP处理组（0.08%和0.16%）分别升至125.07%和118.88%（p<0.01），高于IBMX组（115.86%）。SOD活性检测表明，H₂O₂组SOD活性仅为对照的59.4%，而GP处理组显著升高至150.0%–256.3%。说明GP通过增强抗氧化酶活性和酪氨酸酶活性，减轻氧化损伤并促进黑色素合成。

**3.4 流式细胞术检测B16细胞ROS水平**
DCFH-DA染色结合流式细胞术显示，H₂O₂处理使细胞内ROS荧光强度显著升高，而GP（0.02%–0.16%）处理后荧光强度呈剂量依赖性降低。表明GP有效清除ROS，发挥抗氧化作用。

**3.5 GP调节黑色素合成相关基因的表达**
qRT-PCR结果显示，H₂O₂处理30分钟显著下调MITF、TYR、TYRP1和β-catenin的mRNA表达，而GP处理可逆转这一抑制效应，上调上述基因的表达。提示GP可能通过Wnt/β-catenin信号通路调控黑素细胞的黑色素生成。

**3.6 小鼠毛发色素沉着**
在体内实验中，仅H₂O₂处理组新生毛发呈黄色（脱色素），而GP（0.5%/1%/2%）与H₂O₂联合处理组及阳性对照8-MOP组均出现黑色毛发。HE染色进一步显示，GP处理组小鼠毛囊长度显著长于H₂O₂组。证明GP在体内可抵抗H₂O₂诱导的毛囊脱色并促进毛发生长。

**四、讨论与结论**

讨论部分指出，GP提取物富含绞股蓝皂苷（gypenosides），其强抗氧化活性与观察到的ROS降低、SOD活性升高直接相关。此外，GP可能通过多重机制发挥保护作用，包括抗炎（抑制NF-κB）、抗凋亡（调节Bcl-2家族）及线粒体保护效应，而不仅仅是直接中和ROS。研究还比较了绞股蓝皂苷与其他人参皂苷、茶多酚等天然产物在促进毛发色素沉着方面的相似性与差异，强调绞股蓝皂苷结构多样，可能通过Wnt/β-catenin和MAPK等多通路产生更广谱的生物活性。但研究存在局限性，如Wnt/β-catenin通路的证据仅基于基因表达变化，缺乏蛋白水平验证；体内实验样本量较小（每组5只）且仅使用雄性小鼠。

**研究结论**（翻译原文结论部分）：总之，虽然我们承认某些机制证据的初步性质以及体内研究的规模，但本研究提供了有力证据，表明GP提取物是应对氧化应激诱导白发的一种有效天然候选物。我们证明GP通过以下方式强有力地保护黑素细胞免受H₂O₂诱导的损伤：（1）增强细胞抗氧化防御（例如，增加SOD活性）；（2）显著减少ROS积累；（3）上调关键黑色素生成基因（MITF、TYR和TYRP1）和酪氨酸酶活性；（4）在小鼠模型中有效保护毛囊色素沉着并促进毛发生长。这些多方面的作用，特别是Wnt/β-catenin通路的潜在参与，强调了GP不仅能中和氧化损伤，还能主动刺激色素沉着机制的能力。这些发现牢固确立了GP在预防和潜在治疗氧化应激相关白发中的治疗潜力。鉴于其作为安全传统草药长期使用的历史，GP有望被开发为一种新颖的、基于证据的天然疗法，用于白发及相关皮肤疾病。