KN057（一种组织因子途径抑制物中和抗体）在血友病或VWD3患者血浆中的离体药效学研究

《Haemophilia》：An Ex Vivo Pharmacodynamic Study of KN057, a Tissue Factor Pathway Inhibitor Neutralizing Antibody, in Plasma Samples From Patients With Haemophilia or VWD3

　　

组织因子途径抑制物（TFPI）是通过活化因子X（FXa）依赖性抑制组织因子-FVIIa复合物来调节组织因子启动凝血的关键调节因子，已成为恢复凝血酶生成的有前景的靶点。这项离体药效学研究旨在评估KN057（一种新型人源化TFPI中和抗体）在血友病或3型血管性血友病（VWD3）参与者血浆样本中的作用。在这项离体加药研究中，从血友病或VWD3参与者获取的血浆补充了浓度为0–140.00 nM的KN057。研究人员采用凝血酶生成试验（TGA）和稀释凝血酶原时间（dPT）试验来评估凝血响应。在2021年5月26日至2021年9月3日期间，共有29名参与者入组，包括10名无抑制物的血友病A（HA）患者、6名无抑制物的血友病B（HB）患者、6名有抑制物的HA患者、3名有抑制物的HB患者和4名VWD3患者。在补充了KN057的参与者血浆中，峰值凝血酶和内源性凝血酶潜力（ETP）在1.12–5.60 nM之间显著增加，并在28.00 nM达到最大水平。在所有血友病或VWD3参与者中观察到dPT呈剂量依赖性缩短。KN057在来自HA或HB患者的血浆样本中，无论是否存在抑制物，均表现出一致的离体药效学特征，包括响应趋势和有效浓度范围。此外，其在VWD3患者血浆中的药效学活性与在血友病血浆中观察到的相当。

血友病A（Haemophilia A, HA）和血友病B（Haemophilia B, HB）是由凝血因子VIII（FVIII）或因子IX（FIX）缺乏导致的先天性、隐性X连锁出血性疾病。标准治疗为凝血因子浓缩物（CFC）替代疗法，但存在静脉给药、半衰期短及抑制物形成等限制。3型血管性血友病（VWD3）因血管性血友病因子（VWF）完全缺乏，出血事件严重且频繁，同样存在未满足的临床需求。组织因子途径抑制物（TFPI）作为凝血启动的关键负调节因子，通过FXa依赖性抑制组织因子-FVIIa复合物来限制凝血酶生成，已成为恢复凝血功能的新靶点。当前已获批的抗TFPI药物如marstacimab和concizumab虽为非因子替代疗法的重要进展，但仍存在血栓栓塞风险。KN057是一种新型重组人源化IgG4单克隆抗体，选择性靶向TFPI，通过阻断其与活化因子X（FXa）的相互作用，维持FVIIa-组织因子（FVIIa-TF）复合物的促凝活性。其与人TFPI的亲和力（Kd = 1.37 nM）介于marstacimab（2.63 nM）与concizumab（0.03 nM）之间，提示更可逆的结合特性，可能支持每周一次给药。本研究旨在建立KN057在HA或HB（伴或不伴抑制物）及VWD3患者血浆中的有效浓度范围，为该抗体的后续临床开发提供离体药效学依据。该研究发表在《Haemophilia》。

研究人员共纳入29名参与者，均来自中国医学科学院血液病医院（伦理批准号XY2020034-EC-3），包括10名无抑制物HA、6名无抑制物HB、6名有抑制物HA、3名有抑制物HB和4名VWD3患者。主要技术方法包括：**血浆样本制备**：空腹静脉采血（3.2%枸橼酸钠抗凝），经离心（1500 g，15分钟，室温）分离乏血小板血浆（PPP），保存于?60°C至?80°C。**凝血酶生成试验（TGA）**：将KN057（终浓度0、1.12、5.60、28.00、140.00 nM）与PPP室温孵育30分钟，以PPP-Reagent LOW触发凝血，使用Fluoroskan Ascent荧光读数仪检测荧光强度，通过Thrombinoscope软件计算凝血酶生成参数（滞后时间、峰值凝血酶、内源性凝血酶潜力ETP）。**稀释凝血酶原时间（dPT）试验**：将KN057（终浓度0、0.009、0.045、0.224、1.12、5.60、28.00、140.00 nM）与PPP孵育30分钟，使用SF-8100自动凝血分析仪以磁珠法检测凝固时间，并计算两种归一化比值以降低批间变异。**统计分析**：采用GraphPad Prism 6.01计算EC₅₀，SAS 9.4进行描述性统计和均值-浓度曲线绘制。

研究结果如下：

**3.1 参与者人口统计**：2021年5月26日至9月3日期间，筛选30名参与者，排除1名基线FVIII活性>1%的HB患者，最终29名入组。各组基线FVIII或FIX活性均<1 IU/dL（除个别因既往水平记入），VWD3患者FVIII活性范围为2.2%–36.1%。所有参与者均为男性，VWD3组为女性。通过基线特征描述确认了各亚组的严重出血表型。

**3.2 凝血酶生成**：基于峰值凝血酶和ETP参数，KN057在血友病参与者血浆中呈浓度依赖性增加凝血酶生成。效果在1.12至5.60 nM间显著增强，于28.00 nM达到最大。血友病组平均峰值凝血酶范围85.00–120.00 nM，平均ETP范围1400.00–1650.00 nM*min，而滞后时间保持不变。该剂量-响应模式和有效浓度范围在无抑制物HA、无抑制物HB、有抑制物HA、有抑制物HB各亚组间均一致（TGA数据）。对于VWD3参与者，与血友病组趋势相似，但在KN057浓度为0和1.12 nM时，因基线凝血因子活性较高，其峰值凝血酶和ETP高于血友病组；当浓度≥5.60 nM时，峰值凝血酶差异逐渐缩小，ETP水平趋于可比。

**3.3 KN057缩短dPT**：所有血友病及VWD3参与者的dPT凝固时间均呈剂量依赖性缩短。各亚组（无抑制物HA、无抑制物HB、有抑制物HA、有抑制物HB）及VWD3的剂量-响应模式和有效浓度范围相似。基线dPT均值在无抑制物HA（90.54 s）、无抑制物HB（98.60 s）、有抑制物HA（85.77 s）组间可比，在补充KN057后分别降至74.15 s、79.00 s、68.53 s；有抑制物HB组基线最长（111.40 s），降低27.13 s至84.27 s；VWD3组基线最短（80.10 s），降低13.07 s至67.03 s。所有样本的EC₅₀均值为0.57 nM。两种归一化比值（Ratio 1和Ratio 2）的变化趋势与绝对dPT一致，表明KN057的缩短效果具有一致性。

**3.4 KN057在伴或不伴抑制物血友病血浆中的离体药效学比较**：根据离体药效学曲线选择5.60 nM和28.00 nM两个浓度，以dPT、峰值凝血酶和ETP为评估参数。结果显示，在伴抑制物与不伴抑制物的血浆样本之间，KN057的药效学活性无显著差异。此外，无抑制物HA与无抑制物HB、有抑制物HA与有抑制物HB之间的离体药效学曲线亦相似。

讨论部分总结：TFPI通过FXa依赖性反馈抑制TF-FVIIa复合物，其抑制可使凝血过程向进化上更原始状态逆转，为TFPI靶向治疗血友病提供机制依据。本研究通过TGA和dPT证实KN057在血友病血浆中浓度依赖性增强凝血酶生成，且在不同亚型（HA/HB、伴或不伴抑制物）间表现一致。与concizumab（23.7 nM时峰值约90 nM、ETP约1000 nM*min）和marstacimab（100 nM时峰值约125 nM、ETP约1250 nM*min）相比，KN057在5.60 nM即出现显著增强，28.00 nM接近最大，平均峰值85–120 nM、ETP 1400–1650 nM*min，提示其有效浓度范围较低。dPT结果进一步支持KN057的组织因子启动凝血增强作用。VWD3组的探索性结果显示，KN057可提高其凝血酶生成峰值和ETP，机制上可能通过中和TFPI，减轻因VWF缺乏导致的FVIII活性低下所致的凝血级联放大受损。但本研究存在若干局限：单中心、小样本量（尤其亚组和VWD3），可能限制统计效能和普适性；未进行富血小板血浆（PRP）和全血分析（因样本需2小时内检测的条件限制）；TGA中因浓度点有限且未达平台期而无法计算EC₅₀；测定条件差异可能影响结果。

研究结论翻译：总之，本研究表明KN057在血友病参与者血浆中诱导了促凝响应。KN057的药效学特征和有效浓度范围在不同血友病亚型（包括HA和HB，伴或不伴抑制物）之间基本一致。基于这些离体数据，临床试验（KN057-A-201, NCT05421429）将评估KN057在血友病患者中的临床疗效和安全性。