丙酮酸激酶M2介导芹菜素诱导的结肠癌细胞能量危机与凋亡

《Food Frontiers》：Pyruvate Kinase M2 Mediates Apigenin-Induced Energy Crisis and Apoptosis in Colon Cancer Cells

　　

靶向肿瘤代谢为结肠癌治疗提供了新思路。研究人员发现，天然黄酮类化合物芹菜素（Api）在体内外均能有效抑制结肠癌，且毒性较低。多组学分析显示，Api可协同破坏中心碳代谢及增殖相关通路。机制研究表明，Api处理HCT-116细胞后，下调丙酮酸激酶M2（PKM2）表达，显著抑制乳酸生成，降低糖酵解与氧化磷酸化（OXPHOS）的腺苷三磷酸（ATP）生成速率，并消散线粒体膜电位（MMP），共同诱发严重的生物能量危机。代谢崩溃伴随明显的凋亡效应，表现为凋亡细胞增多及PARP?1与caspase?3剪切增强。关键的是，过表达PKM2可减弱Api诱导的代谢抑制、细胞毒性与凋亡标志物累积，证实PKM2是核心功能靶点。研究确立PKM2为Api诱导能量危机与凋亡的关键功能靶标，为开发低毒结肠癌疗法提供了依据。

论文解读：丙酮酸激酶M2介导芹菜素诱导的结肠癌细胞能量危机与凋亡

研究背景与意义

结直肠癌（CRC）是全球高发且致死率居前的恶性肿瘤，常规手术与化疗常伴随明显副作用、复发及肠损伤，亟需更安全的替代或辅助策略。膳食源黄酮类化合物因其低毒抗肿瘤潜力受到关注，其中芹菜素（apigenin, Api）在多种癌症中显示抑制效果，但其具体作用靶点与代谢调控机制尚未明确。肿瘤细胞依赖糖酵解与氧化磷酸化（OXPHOS）维持高能需求，丙酮酸激酶M2（PKM2）作为糖酵解关键限速酶，常在高表达肿瘤中被劫持以促进增殖并抑制凋亡。基于此，研究人员假设Api可通过靶向PKM2引发能量危机与凋亡，并在《Food Frontiers》发表本研究以验证该假设。

主要关键技术方法

研究人员以人结肠癌细胞系（SW480、HT?29、Caco?2、HCT?116、LS174T）及正常人结肠上皮细胞FHC为体外模型，并以HCT?116异种移植BALB/c裸鼠为体内模型。关键方法包括：CCK?8法检测细胞活力；裸鼠成瘤实验评估体内抑瘤与安全性；慢病毒构建PKM2过表达稳转株；转录组（RNA?seq）与非靶向代谢组学联合分析；流式细胞术（Annexin V?APC/PI）检测凋亡；Seahorse XFp实时ATP速率检测糖酵解与OXPHOS产ATP速率；乳酸检测；线粒体膜电位（MMP）荧光成像；Western blot与免疫荧光检测PKM2、PARP?1、caspase?3等。

研究结果

3.1 Api抑制结肠癌细胞增殖

通过筛选五种人结肠癌细胞系，研究人员发现HCT?116对Api最敏感，48 h半数抑制浓度（IC₅₀）约34.12 μM，且呈剂量与时间依赖性抑制。正常人结肠上皮FHC细胞在≤30 μM、24–48 h内未见明显活力下降，提示选择性低毒。

3.2 Api在体内发挥肿瘤抑制作用

HCT?116荷瘤小鼠中，Api（100、200 mg/kg/d，灌胃）显著抑制肿瘤体积与质量，抑制率分别约36.6%、30.12%（阳性对照奥沙利铂2.5 mg/kg/2 d腹腔注射为54.2%）。Api组体重稳定，仅奥沙利铂组末期明显减重。Ki?67免疫组化（IHC）显示Api降低增殖信号；H&E染色示Api组肿瘤稀疏、坏死增多、核固缩；肝H&E与肝指数未见Api肝毒性，而奥沙利铂组伴炎性浸润与肝指数下降。

3.3 Api诱导代谢与转录改变

非靶向代谢组学主成分分析（PCA）与正交偏最小二乘判别分析（OPLS?DA）显示Api组与对照组分离明显（R²X=0.658, R²Y=1, Q²=0.929），578个代谢物显著变化，富集于“癌症中心碳代谢”“OXPHOS”等。能量代谢物柠檬酸、D?果糖?1,6?二磷酸、焦磷酸、葡萄糖?1?磷酸下调，提示糖酵解与三羧酸循环（TCA循环）受抑；胸腺嘧啶、次黄嘌呤、尿嘧啶等核酸分解产物及L?丙氨酸、甘氨酸升高，反映应激分解代谢。转录组显示1913个差异基因，下调基因富集于“G1/S转换正调控”“细胞葡萄糖稳态”“糖氧剥夺响应”，热图中HK2、ALDOC、PFKFB4（糖酵解），IDH1、NDUFA5、ATP23（线粒体），CUL4B（存活），PLCB1（信号）下调，促凋亡MOAP1上调。

3.4 Api触发结肠癌细胞凋亡

流式细胞术显示20、30 μM Api处理48 h，凋亡率分别约16.39%、25.53%。Western blot示全长PARP?1、caspase?3减少，85 kDa剪切PARP?1增多；免疫荧光可见活性caspase?3平均荧光强度（MFI）分别提升约2.04倍与2.34倍，表明Api通过caspase?3激活与PARP?1剪切诱导凋亡。

3.5 Api破坏细胞生物能量与线粒体功能

Api显著降低培养基乳酸分泌（糖酵解终产物减少），PKM2蛋白表达下调。实时ATP速率测定示糖酵解与OXPHOS产ATP均受抑。MMP荧光成像显示20、30 μM Api使MFI分别降低约33.6%、46.7%，说明线粒体去极化。综上，Api从糖酵解输出、PKM2水平、产能通路到线粒体膜电位实施多层级打击，导致ATP耗竭。

3.6 PKM2过表达部分挽救Api诱导的代谢抑制

构建HCT?116/OE?PKM2稳转株，Western blot确认PKM2上调。基础状态下，OE?PKM2提升乳酸分泌；在Api处理下，对照载体细胞糖酵解与OXPHOS?ATP大幅下降，而OE?PKM2显著减弱该抑制；MMP丢失也部分恢复。表明PKM2过表达增强基线糖酵解通量，并对Api引发的能量危机提供部分抵抗。

3.7 Api通过靶向PKM2触发细胞死亡

功能回补实验显示，OE?PKM2使20、30 μM Api下的平均凋亡率分别降低约9.66%、12.80%，CCK?8活力改善。Western blot示OE?PKM2部分恢复全长PARP?1与caspase?3，减少85 kDa PARP?1片段；免疫荧光中活性caspase?3信号减弱。证明PKM2过表达可部分抵消Api的细胞毒与凋亡诱导，进一步将PKM2定位为Api功能中介节点。

讨论与结论总结

讨论指出，CRC高发与环境饮食相关，Api作为低毒天然分子可抑制多癌种，但机制未明。既往研究涉及Wnt/β?catenin、mTOR、E2F1/miR?215?5p、Mcl?1/AKT/ERK等，而本研究通过多组学聚焦能量代谢。研究人员发现Api广泛扰动代谢与增殖转录，抑制糖酵解/TCA及对应基因，上调促凋亡基因；功能上降低乳酸、PKM2蛋白、双通路ATP与MMP，并激活caspase?3/PARP?1凋亡执行。PKM2过表达部分恢复乳酸、糖酵解?ATP、OXPHOS?ATP与MMP，并减轻凋亡，支持PKM2为关键功能靶。

作者也指出局限：主要在体外细胞与异种移植模型，体内精细机制待深化；PKM2蛋白下调在其转录本未变（表S1），暗示转录后调控；部分挽救提示Api可能多靶点协同（HK2、IDH1等也下调），且黄酮类可直接抑制PKM2酶活性。后续将探究Api下调PKM2蛋白的具体机制及是否影响PKM2构象与活性。

研究结论

在提出的模型中，Api触发代谢紊乱级联：下调PKM2抑制糖酵解通量，同时诱导线粒体去极化与OXPHOS失效，导致HCT?116细胞严重ATP短缺；ATP耗竭进而激活caspase?3与PARP?1剪切，最终凋亡。PKM2过表达的部分挽救凸显其枢纽地位。研究确立PKM2为Api抗癌机制中的关键功能靶之一，为Api作为低毒抗肿瘤制剂（尤其结肠癌）提供理论与实验支撑。