尿素解离处理应用于降低梅毒检测酶联免疫吸附试验（ELISA）假阳性率的评价

《JOURNAL OF CLINICAL LABORATORY ANALYSIS》：Evaluation of the Application of Urea Dissociation Treatment to Reduce the False-Positive Rate of ELISA for Syphilis Detection

　　

目的：探讨尿素解离处理应用于降低梅毒检测酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）假阳性率的效果。方法：2023年1月至2024年1月，研究人员从西安区域医学检验中心收集11份梅毒检测假阳性血清作为实验组，5份阳性标本作为阳性对照组，5份阴性标本作为阴性对照组。所有标本分为A、B、C三组，分别用6 mol/L尿素处理10 min、6 mol/L尿素处理20 min、10 mol/L尿素处理10 min，随后按实验流程操作。结合梅毒螺旋体颗粒凝集试验（Treponema pallidum particle agglutination test，TPPA）和梅毒免疫印迹（immunoblotting）结果分析，采用Wilcoxon检验比较各组S/CO值。结果：A组中标本2和3的S/CO仍≥1.0，而B组和C组完成解离后S/CO＜1.0；实验组的标本7和8在三组中解离后S/CO接近1.0；阳性对照组在三组中S/CO均＞1.0；阴性对照标本解离前后无影响；实验组A、B、C解离前后S/CO差值差异有统计学意义（p＜0.05）；梅毒螺旋体（Treponema pallidum，TP）数值低于厂商允许的不精精密度要求。结论：ELISA结合尿素解离可有效降低梅毒检测的假阳性率。

该研究论文发表于《JOURNAL OF CLINICAL LABORATORY ANALYSIS》（《临床检验分析杂志》）。研究背景方面，梅毒是由梅毒螺旋体（Treponema pallidum，TP）引起的一种急慢性疾病，可损害多系统器官，临床表现复杂。实验室检测分为非梅毒螺旋体（non-treponemal）试验（如性病研究实验室试验（Venereal Disease Research Laboratory，VDRL）、快速血浆反应素试验（rapid plasma reagin，RPR））和梅毒螺旋体（treponemal）试验（如电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）、化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、梅毒螺旋体颗粒凝集试验（Treponema pallidum particle agglutination test，TPPA）、梅毒免疫印迹（Treponema pallidum-Western blot，TP-WB））。其中ELISA常用于筛查，但易受疾病状态、标本溶血、设备、试剂质量、方法学及人为因素等影响而出现假阳性（false-positive），目前多集中于假阳性病例或结果分析报道，关于通过改进方法降低假阳性的研究较少。为解决ELISA梅毒检测假阳性导致误诊的问题，研究人员开展了尿素（urea）解离处理对ELISA假阳性样本S/CO值影响的研究，得出尿素解离能显著降低假阳性样本的S/CO值且不影响真阳性与阴性样本判读的结论，这对临床补充筛查阳性样本、减少不必要的确证检测具有重要意义。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：样本队列来源于2023年1月至2024年1月西安区域医学检验中心收集的17份血清，其中实验组为ELISA的S/CO值1–4且TPPA阴性的11份假阳性样本，阳性对照组为ELISA的S/CO＞4且TPPA阳性的5份样本，阴性对照组为ELISA的S/CO＜1且TPPA阴性的5份样本；将每份样本四等分，分别设为未处理组O、6 mol/L尿素解离10 min组A、6 mol/L尿素解离20 min组B、10 mol/L尿素解离10 min组C；检测手段包括改良ELISA（原ELISA流程中增加尿素解离步骤）、TPPA、梅毒免疫印迹（检测IgG/IgM针对p15 kDa、p17 kDa、p45 kDa、p47 kDa等靶抗原）、化学发光免疫分析（chemiluminescence，CL）以及原ELISA；统计学采用Shapiro–Wilk正态检验、Wilcoxon配对检验、χ²检验（p＜0.05为差异有统计学意义），并进行性能验证（精密度按WS/T492-2016验证批内/批间不精密度，符合率按CNAS-GL038用已知样本评估）。

3 Results（结果）

3.1 Laboratory Characteristics of the Study Subjects（研究对象实验室特征）：研究人员通过表数据显示，实验组ELISA初筛S/CO 1.01–3.79，经A、B、C尿素解离后S/CO普遍下降，其中A组标本2、3仍≥1.0，B、C组均＜1.0；标本7、8在三组解离后S/CO接近1.0；阳性对照组三组的S/CO均＞1.0；阴性对照组解离前后S/CO均＜1.0且无变化；免疫印迹显示实验组ELISA阳性但TPPA阴性、IgG/IgM靶抗原均为阴性，阳性对照组TPPA阳性且IgG/IgM有对应靶抗原带。Wilcoxon检验表明实验组A、B、C与O组比S/CO下降差值均有统计学意义（Z_A-O=5.855，p=0.000；Z_B-O=6.883，p=0.000；Z_C-O=6.346，p=0.000）。精密度验证显示两个浓度水平批内不精密度CV分别为7.02%、8.04%，批间CV分别为6.76%、7.44%，均低于厂商允许的15%。

讨论部分总结：研究人员指出梅毒螺旋体（Treponema pallidum，TP）外膜蛋白（如TpN15、TpN17、TpN45、TpN47）是免疫主要靶点，ELISA双抗原夹心法虽便于自动化筛查，但因抗原包被浓度低可致非特异性结合与交叉反应而假阳性。尿素作为解离剂可使蛋白变性溶解，低亲和力交叉抗体易被解离使S/CO下降，而高亲和力特异性抗体受影响较小。参照Wang Qiang等的6 mol/L尿素10 min条件，本研究增加6 mol/L 20 min和10 mol/L 10 min两组，发现后两者能将A组未转阴的标本2、3降至S/CO＜1.0，说明更高浓度或更长时间解离对较强非特异性结合更有效；实验组中45.45%免疫印迹IgG p45阳性提示部分假阳性可能与低水平特异抗体或交叉抗原有关。改良ELISA仅增加解离步骤，未重设临界值而沿用原ELISA判读，流程简便易推广。精密度符合要求。局限性包括假阳性样本仅11例（效能0.81），未验证稳定性、干扰等其他性能指标。结论翻译：综上，尿素解离可降低假阳性样本的S/CO值。在ELISA中加入尿素处理可用于临床试验中对梅毒筛查阳性样本的补充检测。但梅毒诊断应始终结合实验室血清学结果、临床症状和流行病学调查，以避免交叉反应致误诊或早期感染漏诊。因ELISA假阳性样本收集困难（仅11例），本研究未明确评估改良ELISA的特异性；尿素解离法降低ELISA梅毒假阳性的有效性仍需更多研究验证，不过解离实验表明筛选得出的条件本身不会引发假阳性结果。