用于自阳性血培养中大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌快速可视化检测关键抗生素耐药基因的双重重组酶聚合酶扩增-侧向层析检测

《JOURNAL OF CLINICAL LABORATORY ANALYSIS》：Duplex Recombinase Polymerase Amplification-Lateral Flow Assay for Rapid Visual Detection of Critical Antibiotic Resistance Genes in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae From Positive Blood Cultures

　　

背景
由多重耐药菌（MDR）引起的血流感染（BSIs）是住院患者死亡率和发病率升高的主要原因之一。超广谱β-内酰胺酶（ESBL）、耐碳青霉烯肠杆菌目细菌（CRE）以及黏菌素耐药菌均属于临床上极其重要的抗生素耐药菌。自阳性血培养中快速鉴定这些关键耐药基因，对于加快诊断周转时间、实现早期治疗以及支持有效的抗菌药物管理项目至关重要。

方法
本研究建立了重组酶聚合酶扩增（RPA）结合自建侧向层析检测（LFA）的双重检测方法，用于同时检测 blaCTX-M/mcr-1 和 blaoxa-48-like/blaNDM。研究人员设计了与 LFA 上固定抗体相匹配的 5′ 端修饰引物。对引物浓度、反应温度和反应时间分别在 0.2–0.6?μM、36°C–39°C 和 20–30?min 范围内进行了优化。双重 RPA 扩增产物经缓冲液稀释后，可在 10–15?min 内通过自建侧向层析试纸条进行肉眼可视化检测。研究对检测限（LOD）、特异性及方法学验证进行了评估。

结果
blaCTX-M/mcr-1 和 blaoxa-48-like/blaNDM 的最佳引物浓度分别为 0.35?μM/0.35?μM 和 0.2?μM/0.6?μM，在 37°C–38°C 条件下反应 25?min，可为所有靶基因提供均衡的信号强度。0–8?h 孵育时间范围内的检测限（LOD）为 10⁷–10²?CFU/mL。与其他常见革兰阴性致病菌之间未观察到交叉反应。双重 RPA-LFA 对 blaCTX-M、mcr-1 和 blaoxa-48-like/blaNDM 检测的灵敏度和特异度分别为 85.71%–98.28% 和 93.62%–100%，准确度为 93.33%–96.13%。

结论
所建立的双重 RPA-LFA 检测适用于阳性血培养的快速筛查，可为危重感染中多重耐药菌（MDR）的治疗、监测与控制提供一种具有成本效益的工具。

该研究发表于《JOURNAL OF CLINICAL LABORATORY ANALYSIS》，聚焦血流感染（BSIs）中两类重要肠杆菌科病原——大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌——所携带关键耐药基因的快速检测问题。研究背景在于，临床上由多重耐药菌（MDR）导致的 BSIs 与较高病死率、较长住院时间、重症监护病房（ICU）入住增加及医疗成本上升密切相关。传统血培养、病原鉴定及药物敏感性试验（AST）虽然仍是金标准，但整体流程耗时较长，难以满足危重感染“尽早识别、尽早干预”的临床需求。特别是在超广谱β-内酰胺酶（ESBL）、耐碳青霉烯肠杆菌目细菌（CRE）及黏菌素耐药不断增加的背景下，针对 blaCTX-M、mcr-1、blaoxa-48-like 和 blaNDM 等关键耐药基因建立快速、简便、可视化的分子检测体系，具有明确的临床价值与公共卫生意义。论文指出，这些靶基因分别代表第三代头孢菌素、碳青霉烯及黏菌素等关键抗菌药物耐药的重要分子机制，因此快速筛查其存在情况，有助于尽早优化经验性治疗方案，并促进抗菌药物管理。

研究人员围绕上述问题，建立了两套双重重组酶聚合酶扩增-侧向层析检测（RPA-LFA）体系：一套用于检测 blaCTX-M/mcr-1，另一套用于检测 blaoxa-48-like/blaNDM。该设计避免了单管多重扩增中多引物相互作用引起的非特异性问题，同时兼顾多靶标检测效率。研究结论表明，这一自建双重 RPA-LFA 体系能够在较短时间内完成耐药基因的扩增与可视化判读，且在灵敏度、特异度与准确度方面表现良好，适用于阳性血培养样本的快速筛查。论文的重要意义在于，为资源有限实验室和临床一线提供了一种无需复杂仪器、成本较低、可操作性较强的耐药基因快速检测工具，可用于危重感染的治疗决策支持、耐药监测及感染控制。

研究所采用的主要技术方法包括：首先，以携带目标基因的阳性对照菌株构建检测体系，并采集泰国 Mahidol University Ramathibodi Hospital 于 2024 年 8 月至 11 月间获得的剩余阳性血培养样本共 105 份，同时收集 180 份阴性血培养样本用于加标实验。随后，从血培养样本中提取细菌基因组 DNA，设计带有生物素（biotin）、荧光素（FAM）或地高辛（DIG）标记的 5′ 端修饰引物，建立双重 RPA 反应，并对引物浓度、温度和时间进行优化。扩增产物经自建 LFA 试纸条进行肉眼判读，并辅以灰度密度定量分析。最后，研究评估了方法的检测限（LOD）、对常见革兰阴性菌的特异性，以及其相对于自动化 Sensititre ARIS HiQ 药敏结果的诊断效能。

在研究结果部分，论文按照不同实验目标进行了系统呈现。

3.1 Optimization of RPA-LFA for Duplex blaCTX-M/mcr-1 Genes and blaoxa-48-like/blaNDM Genes Detection
该部分主要通过灰度密度分析筛选双重 RPA-LFA 的最优反应条件。研究结果显示，在所测试的引物浓度、反应温度（36°C–39°C）及孵育时间（20–30?min）范围内，两套双重体系均能实现稳定扩增并被 LFA 检出。对于 blaCTX-M/mcr-1 体系，blaCTX-M 与 mcr-1 引物均采用 0.35?μM 时，两条检测线的信号最均衡且强度最高；温度方面各条件差异不大，但综合两靶标累计信号强度，37°C 最优；虽然信号随时间延长而增强，但为缩短总体检测时间，最终选定 25?min 作为最佳反应时间。对于 blaoxa-48-like/blaNDM 体系，blaoxa-48-like 与 blaNDM 的最佳引物浓度分别为 0.2?μM 和 0.6?μM，在 38°C 条件下获得最高综合信号强度，同样选定 25?min 作为最佳孵育时间。该结果说明，经过参数优化后，两套双重检测体系可在较温和且便于现场应用的条件下完成检测。

3.2 Limit of Detection for Duplex RPA-LFA
该部分评估了方法在不同富集时间下的检测限（LOD）。研究人员将阳性菌株加标至阴性血培养瓶中，并在 0、2、4、6、8?h 不同培养时间点检测。结果显示，blaCTX-M/mcr-1 体系在各时间点的 LOD 分别为 10⁷、10⁶、10⁵、10³ 和 10²?CFU/mL；blaoxa-48-like/blaNDM 体系分别为 10⁷、10⁷、10⁵、10³ 和 10²?CFU/mL。该结果表明，随着额外孵育富集时间延长，检测灵敏度明显提高，至 6–8?h 时可检出较低菌量水平。论文据此指出，尽管高初始菌量可被直接检出，但对低菌量样本而言，短时富集可显著改善检测表现，从而增强该方法在临床阳性血培养应用中的可靠性。

3.3 Specificity of Duplex RPA-LFA
该部分主要验证方法对非目标菌株的交叉反应情况。研究人员使用 12 株血流感染常见革兰阴性菌作为特异性评估面板，包括 Salmonella paratyphi、Citrobacter freundii、Edwarsiella tarda、Pseudomonas aeruginosa、Enterococcus cloacae、Morganella morganii、Enterobacter aerogenes、Vibrio vulnificus、Klebsiella pneumoniae、E. coli、Salmonella typhi 和 Klebsiella oxytoca，并将其加标至阴性血培养中后提取 DNA 进行检测。结果显示，无论是 blaCTX-M/mcr-1 体系还是 blaoxa-48-like/blaNDM 体系，均未出现非特异性扩增或交叉反应，而基质匹配的阳性对照则呈现有效阳性结果。该结果说明，这两套双重 RPA-LFA 体系对目标耐药基因具有较高分析特异性。

3.4 Validation of Duplex RPA-LFA With Clinical and Spiked Samples
该部分进一步从临床或模拟临床样本层面验证方法性能。对于 blaCTX-M 检测，研究使用 58 份产 ESBL 大肠埃希菌阳性临床血培养样本以及 47 份非 ESBL 产菌阳性血培养作为阴性对照，并以表型药敏结果为参照。结果显示，该方法检测 blaCTX-M 的灵敏度为 98.28%，特异度为 93.62%，准确度为 96.19%。由于临床上黏菌素耐药和碳青霉烯耐药血流感染样本有限，研究采用阴性血培养加标方式，对 mcr-1、blaoxa-48-like 和 blaNDM 的检测性能进行验证。结果显示，mcr-1 检测的灵敏度为 85.71%，特异度为 97.87%，准确度为 93.33%；blaoxa-48-like/blaNDM 检测的灵敏度为 90.0%，特异度为 100%，准确度为 96.10%。这些数据表明，该方法在不同耐药基因检测中均具有较高的诊断效能，尤其在特异度方面表现突出。

论文讨论部分围绕该方法的临床适用性、技术优势、局限性及拓展前景展开。研究人员指出，BSIs 的快速分子诊断技术应尽可能满足 ASSURED 标准，即可负担（Affordable）、敏感（Sensitive）、特异（Specific）、易用（User-friendly）、快速且稳健（Rapid and Robust）、无需设备（Equipment-free）以及可交付终端用户（Deliverable to end-users）。本研究建立的双重 RPA-LFA 体系正是朝这一方向推进。其优势主要体现在：一是检测时间短，RPA 扩增约需 20–30?min，LFA 判读约需 10–15?min；二是结果可直接肉眼判读，无需复杂仪器；三是自建试纸条可同时提供两条检测线和一条内对照线，适合现场快速筛查；四是成本相对商业化 LFA 更低。研究还解释了其检测原理，即经 biotin 与 FAM 或 DIG 双标记的 RPA 产物，与抗生物素胶体金纳米颗粒（AuNPs）结合后，在层析过程中被检测线上的抗 FAM 或抗 DIG 捕获，形成可视红线。

同时，讨论部分也客观指出了方法的局限。首先，检测限受样本富集时间影响较大，低菌量样本往往需要额外孵育才能提高检出率。其次，直接来源于全血培养体系的 DNA 提取过程较纯培养菌落更复杂，可能影响检测灵敏度。再次，假阳性可能来源于非特异扩增产物、引物二聚体或既往扩增产物污染；假阴性则可能与目标外耐药机制有关，例如其他 β-内酰胺酶基因或其他 mcr 变体未被本方法覆盖。样本处理相关因素，如 DNA 提取缓冲液残留或富集培养基成分，也可能干扰 RPA 反应表现。因此，尽管该方法与表型耐药结果之间存在一定不一致性，但整体上仍显示出作为资源有限地区即时检测工具的应用潜力。论文还提到，该平台具有模块化特征，未来可进一步拓展至其他耐药基因监测场景。

研究结论部分可译为：本研究建立的双重 RPA-LFA 是一种有前景的工具，可用于检测血流感染（BSIs）中的多种关键抗微生物耐药基因，包括 blaCTX-M、mcr-1、blaNDM 和 blaoxa-48-like。该检测体系表现出较高的灵敏度和特异度，与基准方法相当。此外，引入富集步骤可有效提高检测限，从而保证在较低初始菌负荷条件下的检测可靠性。对这些关键耐药基因进行快速筛查，对于危及生命感染的有效治疗管理至关重要。除血流感染外，该双重 RPA-LFA 还可能适用于其他临床标本，为推进精准医学并减少抗微生物耐药传播提供一种可扩展的解决方案。