《United European Gastroenterology Journal》：Potential of Clinical Care-Collected Gut Biopsies for Advancing Personalised Medicine in Inflammatory Bowel Disease
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炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）的管理面临患者异质性显著及有效分型工具匮乏的挑战。本综述评估了存档的福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed, paraffin-embedded, FFPE）肠道活检样本作
炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）的管理面临患者异质性显著及有效分型工具匮乏的挑战。本综述评估了存档的福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed, paraffin-embedded, FFPE）肠道活检样本作为转化医学与精准医疗资源的应用潜力——这类样本在全球范围内广泛可及，且关联长期临床数据。近期技术进展已将FFPE样本的分子检测工具箱拓展至蛋白质组学、代谢组学、糖组学、空间转录组学，以及通过16S核糖体RNA（16S rRNA）测序表征微生物组分。尽管潜力巨大，FFPE材料的应用仍受限于异质性的收集与存储方法。因此，研究人员建议制定标准化的常规IBD活检管理指南，以促进高质量研究开展、深化疾病认知，并支持具有临床转化价值的生物标志物的识别。
1 引言
炎症性肠病（IBD）因疾病异质性，其管理始终存在挑战。分子表型分析为定义个体疾病特征、开发具备诊断、预后、预测及监测潜力的生物标志物，进而实现个体化治疗策略提供了可行路径。全球病理实验室与医院中广泛存档着来自诊断与手术操作的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织标本，其代表了具备长期临床随访数据的真实世界大型患者队列。相较于耗时、昂贵、劳动密集且患者招募存在选择偏倚的干预性临床试验，基于真实世界生物样本的研究策略可作为重要补充。真实世界数据可覆盖传统试验中代表性不足的患者亚群，有望提升研究结果在真实临床场景中的普适性与可推广性。本文即围绕储存的肠道活检样本在IBD研究中的应用潜力展开探讨。研究人员深入分析了FFPE活检样本作为转化医学与精准医疗资源的可能性，重点聚焦可在存档样本上开展的分子分析，包括组织中微生物组分的表征。随后进一步讨论了储存的FFPE材料在推进个体化医疗方面的更广泛机遇，以及此类样本用于研究时必须解决的方法学与伦理学考量。上述内容共同凸显了FFPE组织资源库在未来以组学驱动的个体化医疗策略中的核心作用。
2 基于FFPE活检样本的的分子分析
近期技术进展已将FFPE样本的分子检测工具从传统组织学与免疫组织化学拓展至代谢组学、蛋白质组学与糖组学，但FFPE样本也存在独特的技术挑战，可能影响数据质量与结果解读。
蛋白质组学分析的可行性随交联材料中蛋白质高效回收与酶解方法（如抗原修复）的发展显著提升。激光捕获显微切割（Laser Capture Microdissection, LCM）与质谱成像（Mass Spectrometry Imaging, MSI）等技术可实现空间分辨的蛋白质组学分析，在保留组织结构的同时提供细胞类型特异性见解。针对蛋白质检测的靶向与非靶向质谱工作流程已针对FFPE完成优化，但蛋白质交联与降解仍是主要挑战。甲醛诱导的修饰会影响肽段的鉴定与定量，且不同组织区域的蛋白质回收效率存在差异。尽管存在这些局限，空间蛋白质组学已成功应用于肠道活检的炎症性疾病研究。
此前，FFPE标本的代谢物信息提取研究较少，主要原因是学界担忧固定与包埋过程会造成代谢物的化学改变或降解，导致代谢物丢失或表征偏差。但初步证据表明，特定代谢物可在FFPE组织中保持化学与空间稳定性，适用于分子分析。基于组织学的质谱成像已被证实是一种可行的无标记、多重检测方法，可直接在组织学背景下实现代谢物的空间定位，为存档组织样本的回顾性分子研究提供了有力工具。尤其是结合FFPE组织的空间代谢组学质谱成像属于新兴但受技术限制的领域。虽然新鲜冷冻组织仍是代谢组学的标准样本，但基质辅助激光解吸电离质谱成像（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization MSI, MALDI-MSI）与解吸电喷雾电离质谱成像（Desorption Electrospray Ionization MSI, DESI-MSI）的最新适配版本显示，部分代谢物——尤其是脂质与小分子非极性代谢物——可在FFPE切片中检出。主要挑战来自固定过程中的降解、化学修饰以及包埋过程中的代谢物流失。但保留的空间背景对探索隐窝-绒毛轴或炎性病变邻近区域的代谢物分布具有重要价值。结合多重成像技术，空间代谢组学可为肠道内的代谢重编程、药物命运及宿主-微生物互作提供见解，尽管目前其灵敏度与检测深度仍低于新鲜冷冻组织。
细胞相互作用的关键分子群之一是细胞膜蛋白的聚糖。FFPE组织的聚糖分析发展相对滞后，但在肠道生物学领域关注度逐渐提升——聚糖在宿主-微生物互作与黏膜免疫中发挥关键作用。针对FFPE组织的质谱成像方法可靶向聚糖，包括采用组织内酶促反应（如肽N-糖苷酶（Peptide:N-glycosidase, PNGase））使聚糖适用于质谱成像分析。甲醛固定可能掩盖聚糖表位或改变糖基化模式，增加结果解读难度，但新兴工作流程已可提供空间聚糖图谱信息，有望与蛋白质组学、代谢组学数据形成互补。
FFPE活检样本为整合组织病理学背景与生化见解的空间分辨分子分析提供了独特机会。将FFPE组织用于空间转录组学以获取基础生物学洞见，是深入理解分子过程的强效方法，较新的技术已实现微米级空间分辨率分析。该方法正逐步实现更高通量，支持队列层面的筛查。RNA降解（包括信使核糖核酸（mRNA）稳定性与测序至关重要的多聚腺苷酸（polyA）尾丢失）这一缺陷已得到广泛认知。为缓解这些局限，最初为新鲜冷冻组织与其他低质量样本开发的协议已被适配用于FFPE。
综上，新型分子与组学导向的分析方法正将FFPE组织从静态档案转化为动态分子信息来源，在临床研究与机制发现中的潜力持续提升。
3 FFPE组织中微生物组分的表征
FFPE活检中的细菌组分可进行部分表征，这在IBD研究中尤为重要——微生物检测结果可为宿主-微生物互作、菌群失调及其在疾病发病机制中的作用提供关键洞见。FFPE组织为基于16S核糖体RNA（16S rRNA）测序的回顾性微生物组研究提供了宝贵的遗传物质。已有综述汇总了已发表的利用FFPE组织（包括结直肠癌标本、新生儿肠道样本等）开展的微生物组研究。但FFPE样本用于微生物组测序存在显著技术挑战，限制了整体可行性。
FFPE诱导的改变对微生物分析尤为不利：DNA序列质量下降与嵌合序列增加会导致分类学归属错误，从根本上损害微生物组分析结果。具体而言，FFPE流程会改变构成黏液的黏蛋白的结构与溶解性，可能影响黏膜微生物组成。此外，FFPE组织的微生物含量通常较低，更易受到背景/环境噪声与试剂污染的影响，同时宿主DNA的高丰度共提取进一步增加了微生物信号检测的难度。已有研究表明，实验室试剂、石蜡与提取试剂盒中的环境污染物会扭曲结果，因此必须纳入不同类型的阴性对照与阳性对照，并使用（计算）去污染方案，这对结果解读至关重要。目前尚无专门针对FFPE组织微生物组相关分析的计算去污染工具，但多项低生物量微生物组研究已采用适配的去污染框架（如基于对照的扣除法、流行率过滤法）以及decontam、miroDecon等常用计算方法。近期有团队报道了“微生物组污染源追踪去除法（Source-tracking for Contamination Removal in microBiomes, SCRuB）”，这是一种利用对照样本对基于计数的微生物数据进行高精度去污染的方法，已在人类肿瘤微生物组研究中成功应用，有望用于FFPE组织的微生物组分析。
现有证据进一步表明，FFPE组织中检出的细菌群落无法完全复现匹配的新鲜冷冻样本中的菌群，引发了对FFPE来源微生物组数据生物学相关性的担忧。尤其是固定时长（有时可达数年）、存档时间与提取方法的差异，会导致微生物谱相较新鲜/冷冻组织出现偏移。因此，FFPE组织的微生物组测序可行性具有条件依赖性，且与应用场景相关。对于需要广谱微生物群落分析的研究，新鲜冷冻标本仍是金标准。但对于特定微生物标志物的靶向分析，或当存档标本是唯一可用资源时，FFPE组织可提供有价值但有限的洞见，尤其是在采用巢式聚合酶链式反应（Nested Polymerase Chain Reaction, PCR）或实时荧光定量PCR（Quantitative/Real-time PCR, qPCR）以提高目标微生物或相关毒力基因的检测灵敏度时。此外，近期已有研究成功在DNA提取前结合激光捕获显微切割（LCM）或激光显微切割（Laser Microdissection, LMD）对组织内的微生物群落进行定位，提供了新的可能性。同时，将同一FFPE样本的微生物组数据与宿主基因组、转录组、蛋白质组及代谢组数据相结合，被认为是增强生物学洞见的 promising 路径。
4 储存FFPE样本的应用机遇
在部分国家（如北欧各国），存档的常规诊疗收集的FFPE样本可提供具备长期临床随访数据的大型患者队列。活检通常在具有临床意义的时间点采集，如诊断时、复发期、评估药物不良反应时、考虑调整治疗或手术时。因此，IBD诊断前的活检可代表治疗启动前的早期病理生理事件，而随访期间的活检可用于解答与临床场景相关的特定研究问题，如药物应答、术后结局、药物不良事件等。这类研究可覆盖临床试验中通常代表性不足的罕见事件。此外，约10%的成人IBD患者会发生诊断变更，这一现象可被真实世界数据捕捉，却常被前瞻性研究的基线收集遗漏。通过系列测量描绘疾病轨迹是另一独特的研究机遇，有助于理解疾病进展、识别关键转折点，并基于个体患者的长期模式定制干预措施。最后，一项研究发现绝大多数IBD患者在诊断与随访期间接受了活检，若成为常规操作，将提升试验结果在真实临床实践中的普适性与可推广性。
5 使用储存活检开展研究的考量因素
上述所有方法均基于活检组织切片，且建立在传统组织学观察（如苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin, H&E）染色）与抗体染色的基础上。H&E染色组织可提供的信息量不容低估，尤其是当病理学家借助人工智能（Artificial Intelligence, AI）图像分析工具辅助时。在此背景下，开发用于监测黏膜愈合、预测临床结局的稳健组织学评分体系具有前景，若能将其有效整合入AI系统，可进一步提升诊断准确性，支持更个体化的治疗决策。
如前文详述，FFPE微生物组分析的主要挑战之一是甲醛固定导致的脱嘌呤与交联，以及随储存时间延长而加剧的片段化，共同造成DNA质量与长度受限。但目前可用的替代固定剂极少，且无一优于甲醛。已有全面综述探讨了减轻DNA损伤的策略。甲醛固定的逆转可用于RNA研究，但难以在大规模研究中推广。
此外，储存条件可能存在差异（如大气条件不同），进而影响样本 deterioration 的概率。各国常规样本的储存时长往往存在差异，甚至同一国家内部也不统一，外包给大型存档机构的情况十分常见。英国皇家病理学院建议石蜡组织块保存30年，组织切片与数字图像至少保存8年。
IBD的采样方案在国与国之间、同一国家内部甚至单一机构内部都存在显著差异。欧洲克罗恩病和结肠炎组织（European Crohn's and Colitis Organisation, ECCO）建议溃疡性结肠炎确诊需行回结肠镜检查，并从结直肠与回肠末端5个部位各取至少2份活检，同时从内镜表现最严重的区域（若存在溃疡则取溃疡边缘）额外取样，但该建议并未被广泛遵循，且各国与国际层面可能存在不同的推荐方案。此外，IBD随访的内镜采样方案比疑似新发IBD的采样一致性更低。
将内镜活检样本送至病理实验室的方式也存在较大差异：将所有部位的活检放入同一个标本容器（普遍认为是较差的操作）、每个部位使用单独的标本瓶（可可靠识别活检部位、降低样本混杂风险，但增加成本与资源消耗）、使用多孔容器或微盒（比单独标本瓶经济得多，但增加混淆风险、减少可送检的碎片数量）。财务与环境考量常优先于理想方案的采纳，如何消除这些不一致性目前尚无明确方案。
临床元数据往往有限，缺乏疾病活动度、饮食、生活方式与微生物组相关信息。许多国家基于医学系统命名法国际分类（Systematised Nomenclature of Medicine, SNOMED）为每个FFPE样本存储解剖与病理信息，包括解剖定位（部位（T））与组织、细胞及其他结构形态学改变（形态学（M））。部分国家（包括北欧国家）可将此信息与国民健康服务登记系统关联，获取诊断编码、就诊记录、用药情况、手术史与实验室检测结果等详细信息。
疾病部位也会影响FFPE活检的研究适用性：内镜采集的肠道活检可能更能反映溃疡性结肠炎的病变机制，而克罗恩病的病变呈斑片状、透壁性，活检可能无法准确反映黏膜下层及更深层的临床相关改变。
最后还需考量从物理储存中调取活检样本的可行性。为应对研究条件的异质性，研究报告中应提供包括采集、固定、处理、储存在内的一系列前分析因素的详细信息，已有学者提出了科学手稿中需提供的最低限度技术信息建议。
多数国家对常规诊疗收集材料的科研使用均有伦理法规约束，例如英国《人体组织法》对英格兰、威尔士与北爱尔兰地区的人体组织移除、储存、使用与处置活动进行监管。
6 解锁临床收集肠道活检的精准医疗潜力
从伦理角度看，利用现有资源改善患者结局是责任所在。基于上述讨论，研究人员强烈建议制定IBD常规诊疗活检管理指南。部分领域（如肿瘤治疗）已建立常规临床活检采集与储存的标准化流程，若IBD诊疗采用类似标准化程序，将促进高质量研究开展，通过纳入更多样化的患者群体提升公平性，深化对疾病机制的认知，助力识别具有临床相关性的生物标志物。
综上，尽管存档的常规诊疗活检材料研究潜力巨大，但活检收集与储存方法的异质性仍阻碍其广泛应用。FFPE组织在分子研究中前景广阔，尤其适用于通过系列测量回顾性描绘疾病轨迹与开展空间分辨研究。克服方法学挑战，建立与部分国家肿瘤领域已实施实践类似的常规诊疗活检收集与储存标准化流程，是获取IBD新洞见的关键。
