时空单细胞图谱揭示猪发育过程中的调控动态与驯化细胞靶点

《iMeta》：A spatiotemporal single-cell atlas of porcine development reveals regulatory dynamics and cellular targets of domestication

　　

系统性表征家畜组织发育过程中的细胞基因表达对于理解复杂性状的调控至关重要。尽管目前家畜细胞图谱的绘制已取得一定进展，但组织发育的动态视角仍然缺乏。在本研究中，研究人员联合应用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单核RNA测序（snRNA-seq），构建了包含252,033个细胞/细胞核的综合单细胞转录组图谱，跨越猪从产前到产后的五个 sheep发育阶段，在五个组织中共鉴定出83种不同的细胞类型。研究发现，器官发生过程中组织结构的协同重塑是通过干/祖细胞增殖、谱系定向和功能成熟实现的。研究人员鉴定了驱动谱系特异性和时空动态转录程序的关键转录因子及其调控网络。发育轨迹分析揭示了免疫细胞保守的分叉式转录组织结构，伴随着与免疫细胞成熟相关转录因子的动态变化。整合多组学、单细胞和猪群体基因组学数据，研究人员鉴定出MYOT基因的肌肉特异性增强子为人工选择靶点，该位点决定了亚洲猪与欧洲猪品种间的肉质差异。此外，猪与人类之间的跨物种比较揭示了保守的细胞类型，强调了进化联系。综上所述，该综合猪发育细胞图谱为理解家畜发育、指导精准育种提供了重要资源，并凸显了参考猪细胞图谱在生物医学研究中的价值。

猪（Sus scrofa）作为重要的经济家畜和生物医学模式动物，因其在解剖学、生理学和免疫学方面与人类高度相似而备受关注。理解猪发育的遗传调控对于推动农业改良和人类疾病模型研究具有重要意义。然而，目前对猪发育生物学在细胞和分子层面的认识仍然分散且fragmented。

近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单核RNA测序（snRNA-seq）技术的进步为解析猪细胞复杂性和组织异质性提供了新视角。已有研究对猪的肝脏、肺、皮肤、肾脏和骨骼肌等多种组织进行了scRNA-seq分析，揭示了广泛的细胞异质性和多样化细胞群体的转录特征。然而，这些研究大多聚焦于单一组织或特定发育阶段，导致猪多器官发育过程中的协同细胞和分子动态仍不清楚。发育是一个动态且精密的调控过程，涉及多组织间基因表达的复杂时空协调。尽管单细胞发育图谱已在多个物种中阐明了阶段特异性的细胞组成和转录调控变化，但猪仍缺乏全面的跨组织框架来捕捉这些动态。

为此，研究人员构建了高分辨率的猪发育单细胞转录组图谱，涵盖从胚胎发生到成年的五个发育阶段，包括肝脏、肺、肾脏、心脏和骨骼肌五种代表性组织。该数据集包含超过25万个高质量转录组，鉴定了83种细胞类型，整合呈现了猪发育过程中的细胞组成、谱系轨迹和调控景观全貌。

在"猪发育的单细胞图谱揭示细胞组成的时空动态"部分，研究人员对五个组织在五个发育阶段的细胞进行了分析。经过质量控制，获得252,033个高质量单细胞/细胞核转录组。UMAP分析显示细胞按组织来源和发育阶段聚类，表明时空因素对转录组有显著影响。基于431个经典标志基因的表达，83种细胞类型被注释为免疫、内皮、上皮、基质、红系、神经和肌肉七大谱系。细胞谱系按发育时间排序，揭示了谱系组成随阶段的动态变化。心脏和背最长肌中基质和肌肉细胞占主导，而肝脏则显示明显的时序重组：红系细胞在胎儿期占主导，出生后急剧下降，免疫和上皮谱系逐步扩增。通过比较相邻发育阶段的细胞比例变化，发现肌肉、上皮和免疫谱系在发育过程中逐步扩增，而红系和基质谱系减少，反映了从胚胎到成年阶段通过干/祖细胞增殖、谱系定向和功能成熟实现组织结构协同重塑。

在"转录方差分解鉴定谱系和组织为主要驱动因素并 pinpoint关键发育转折点"部分，研究人员对全局转录组方差进行了分解。Spearman相关分析显示胎儿发育期间肌肉与基质谱系、以及免疫细胞间存在强相关性，表明这些细胞类型在胎儿发育期间共享功能特性。主成分分析（PCA）和主方差成分分析（PVCA）显示细胞谱系和组织来源是转录异质性的主要贡献因素，分别解释46.3%和13.6%的总方差。差异表达基因分析显示，出生（PN0）是多个谱系的系统性转录拐点，对应宫外生活所需的关键生理适应。神经谱系中，PN0 vs E80和PN28 vs PN0的比较包含了超过80%的差异表达基因，反映出生后快速神经重塑以处理新感觉刺激和调节自主功能。红系谱系中超过50%的差异表达基因出现在PN28 vs PN0比较中，对应从胎儿血红蛋白向成人血红蛋白的转换和对肺呼吸的适应。免疫细胞类型在出生前后也表现出差异表达基因的集中，反映环境抗原暴露引发的新生儿免疫系统建立。相比之下，肌源细胞和肌腱细胞的显著转录变化发生在发育早期（E80 vs E38），表明其主要表型决定发生在晚胚胎期而非出生时。

在"调控网络驱动猪发育中的谱系定向和功能成熟"部分，研究人员联合高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）和pySCENIC转录因子调控子推断，系统表征了猪发育的调控逻辑。hdWGCNA鉴定了15个具有明显时空特异性的模块，涵盖早期基质建立、产后代谢特化和免疫激活等过程；pySCENIC解析了568个调控子，组织成八个主要模块，发现不同谱系身份与特征性主调控因子集合相关。例如，SOX17/GATA6为中心的血管程序（M1）和MEF2C/GATA4为中心的收缩性成熟程序（M2）与结构组织特化相关；适应性免疫程序（M6中的NR4A1、GATA3和TBX21）和红系谱系定向（M7中的GATA1和KLF1）也有专门的调控子。通过与已有猪免疫细胞snATAC-seq数据整合，研究人员验证了预测的调控连接具有功能活性：M8模块中KLF4预测靶位点的染色质可及性显著富集2.5倍，GATA2富集1.6倍。

研究还观察到发育进程伴随调控子活性的动态时序转换。上皮谱系中，产前与胚胎形态发生相关的M5模块（HNF4A/HOXA10）在产后被与代谢稳态相关的M4模块（FOXA1/FOXA2）取代。共享调控程序在不同组织按发育背景差异部署：收缩性M2模块在肌肉谱系中活性渐进增加，而在基质区室中呈现围绕出生的双相模式。

在"免疫发育的时空景观揭示分叉轨迹和组织适应性调控"部分，研究人员分离分析了74,572个免疫细胞，鉴定出29种免疫细胞亚型，包括B细胞、浆细胞、多种T细胞亚群（DNT、CD4⁺CD8⁺ T、活化T细胞）、NK/NKT细胞、肥大细胞、树突状细胞（cDC1、cDC2和pDC）、中性粒细胞、单核细胞、巨核细胞、Kupffer细胞及多种巨噬细胞亚型。免疫细胞最早在E38即可检测到，其丰度和多样性在整个胎儿和成年阶段持续增加。髓系细胞在胚胎期（E38和E80）占主导，而淋巴细胞在出生后（PN0、PN28和PN180）比例显著增加。组织特异性分布模式明显：巨噬细胞是肌肉和心脏中唯一检测到的免疫细胞类型，而肾脏、肺和肝脏显示出更高的免疫多样性。

伪时序分析鉴定出免疫细胞的双叉转录轨迹：红系样细胞占据前分支区域，随后分为两个转录不同的分支，分别富集髓系和淋巴细胞。这一分支拓扑结构在不同组织和发育阶段一致出现，提示免疫多样化背后存在保守的转录架构。髓系定向由BATF3、IRF8和SPI1等转录因子驱动，与内吞和吞噬作用相关；淋巴分支则以LEF1、KLF6、MYC和IKZF1为特征，参与淋巴细胞分化和活化。这些转录因子呈现广泛的时空和组织特异性表达模式。

在"驯化选择信号的细胞解剖揭示神经和肌肉谱系为主要靶点"部分，研究人员整合了亚洲和欧洲家猪品种的正选择信号与时空细胞图谱。驯化猪自与野猪分化以来经历了强烈的人工选择，表现为体型、头/体组成和繁殖性状等方面的剧烈变化以适应人类需求。尽管选择清除区域已在基因组水平广泛鉴定，但驯化表型效应背后的关键细胞类型仍 largely unknown。研究发现，亚洲和欧洲家猪中受强选择的基因在神经、肌肉和基质谱系中高度富集，肌肉相关选择信号从E80开始变得显著，与活跃肌源性分化开始时间吻合。功能富集分析显示亚洲和欧洲猪之间存在不同的生物学过程选择，包括轴突导向、神经系统发育、细胞内信号转导、微管细胞骨架组织和RNA聚合酶转录调控等。

最为显著的表型差异在于肉质性状。研究人员进一步调查了肌肉相关细胞类型中选择基因的表达。关键选择基因MYOT（Myotilin，编码Z盘相关蛋白，对肌动蛋白丝稳定性和肌节完整性至关重要）在成肌细胞、肌细胞和成肌核中表达最高。值得注意的是，MYOT在欧洲品种中的表达显著高于亚洲品种。表型组关联研究揭示MYOT变异与肉类生产性状强烈相关。综合这些基因组和表型数据，MYOT被认为是可能促成欧洲和亚洲猪品种肉类生产相关性状差异的选择候选靶点。

在"猪和人类产前细胞谱系的转录组保守性与分歧"部分，研究人员将猪的数据集与公开可用的人类产前单细胞参考数据整合，系统量化了跨组织谱系的转录组相似性。分析揭示了猪和人之间细胞谱系特异性基因表达的稳健保守性，特别是在内皮、基质和免疫细胞谱系中。Monocle 2重建的人类免疫细胞伪时序轨迹同样显示出分叉转录轨迹，包含富集淋巴细胞和髓群体的两个转录不同分支，与产前猪细胞观察到的模式一致，提示免疫多样化相关的保守转录架构跨物种保守。此外，研究人员将GWAS来源的人类疾病相关基因映射到其猪同源基因，评估其在组织和细胞谱系中的富集，观察到疾病基因表达模式的显著保守性，特别是在基质和免疫细胞中，表明猪模型适合探索这些细胞谱系的疾病病因学。

讨论部分，研究人员首先指出该研究构建的动态单细胞转录组图谱大幅扩展了现有细胞景观，为深入理解猪发育和调控动态提供了基础。研究鉴定了出生（PN0）周围的显著转录重编程，对应从胎儿到产后生活的重大生理转变，伴随细胞组成的大规模转变——如红系主导被免疫和上皮扩张取代——以及共享细胞类型在组织间的功能重塑。

通过整合hdWGCNA和SCENIC调控网络分析，研究人员从系统层面理解了猪器官发育的转录程序。hdWGCNA模块不仅统计构建，更代表由明确调控控制支撑的生物学相干转录线路。例如，红系相关模块富集由GATA1和KLF1驱动的调控子，肝细胞模块则由HNF4A和CEBPA调控的基因集主导。

跨组织免疫分析揭示了明显的成熟梯度、组织特异性特化和保守的分叉转录轨迹。M6和M8调控子——分别与淋巴分化和细胞应激反应相关——在免疫和内皮细胞中共激活，突显血管与免疫系统之间的协同成熟过程。这种cross-talk提示免疫发育不仅由内在谱系程序驱动，还受塑造免疫成熟、运输和组织归巢的基质和内皮相互作用影响。

通过整合细胞类型分辨的转录组图谱与基因组选择清除数据，研究人员为解释驯化的表型效应提供了细胞框架。选择信号并非在所有细胞类型或组织中均匀分布，某些组织和细胞类型在选择区域基因富集度更高。肌肉、神经和基质细胞谱系中受选择基因特别富集，提示人工选择优先靶向这些细胞群体以调节生长速度、肉质和脂肪沉积等性状。

跨物种比较进一步揭示了细胞类型和谱系特异性调控特征的实质性保守性，凸显了猪作为生物医学模型的转化相关性。尤其值得注意的是，猪和人免疫相关细胞的伪时序轨迹重建均显示出保守的分叉转录架构，以两个分别富集淋巴细胞和髓群体的转录不同分支为特征。基质和免疫细胞中疾病相关基因表达模式的显著保守性进一步凸显了参考猪细胞图谱在生物医学研究中的价值，同时物种特异性差异也界定了猪模型应用于人类发育和疾病研究的重要边界。

研究也承认了若干局限性：样本局限于巴马猪品种，可能无法完全推广至所有猪品种；整合scRNA-seq和snRNA-seq数据存在技术复杂性，scRNA-seq和snRNA-seq的固有成见如细胞质与核RNA丰度差异、非聚腺苷酸化转录本检测率差异等可能影响细胞类型注释分辨率；选择清除区域与特定细胞类型的关联仍属初步，需要CRISPR干扰或ATAC-seq等功能实验验证因果关系。

研究结论：本研究建立了猪发育的跨组织单细胞转录组图谱。研究揭示协调的干/祖细胞增殖、谱系定向和成熟是器官发生的基础，由动态转录网络调控。轨迹分析进一步揭示了与免疫细胞多样化相关的保守转录分叉模式。与群体基因组学的整合鉴定出MYOT基因附近的肌肉增强子为选择靶点，与肉质差异相关。跨物种比较确认了与人类的实质性细胞保守性。该图谱共同为理解哺乳动物发育、指导精准育种策略以及推进猪作为生物医学模型提供了关键资源。