《Immunity, Inflammation and Disease》：Propolis Flavonoids Ameliorate Chronic Osteomyelitis in a Rat Model by Modulating TAZ-Regulated Treg/Th17 Balance
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目的：研究人员旨在通过转录共激活因子PDZ结合基序（TAZ）介导的调节性T细胞（Treg）/辅助性T细胞17（Th17）稳态调节，探究蜂胶黄酮（PF）治疗慢性骨髓炎（COM）的机制。方法：将60只三月龄Wistar大鼠随机分为对照组、模型组和PF治疗组。体外，
目的：研究人员旨在通过转录共激活因子PDZ结合基序（TAZ）介导的调节性T细胞（Treg）/辅助性T细胞17（Th17）稳态调节，探究蜂胶黄酮（PF）治疗慢性骨髓炎（COM）的机制。方法：将60只三月龄Wistar大鼠随机分为对照组、模型组和PF治疗组。体外，将人外周血单个核细胞（PBMCs）和大鼠PBMCs分为五个处理组：对照组（10%健康对照（HC）血清）、骨髓炎模型组（15 ng/mL转化生长因子-β1（TGF-β1）+10%HC血清）、模型+PF组、TEAD（TEA结构域转录因子1，TEAD1）+模型组，以及TEAD1+模型+PF组。通过蛋白质印迹（Western blot）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞术分析TAZ信号组分（TAZ、RAR相关孤儿受体γt（RORγt）、叉头框蛋白P3（FOXP3））、炎症细胞因子（白细胞介素（IL）-17、IL-21、IL-2、IL-10）及T细胞亚群（Th17/Treg比值）。使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）测定法量化骨膜细胞增殖。通过菌落形成单位（CFU）计数量化骨组织中的细菌负荷。结果：与未经治疗的骨髓炎模型相比，PF给药显著上调TAZ蛋白表达（p < 0.05）。PF治疗显著降低骨组织中的细菌负担（p < 0.001）。在PF组中，与骨髓炎模型组（1.58 ± 0.31%）相比，Th17细胞比例增加（2.28 ± 0.35%），RORγt表达升高，同时与骨髓炎模型组（11.5 ± 0.29%）相比，Treg群体减少（1.66 ± 0.27%），FOXP3水平降低。值得注意的是，PF治疗组中促炎细胞因子IL-17和IL-21减少，而抗炎细胞因子IL-10和IL-2增加。PF干预显著改善骨膜细胞增殖率。TEAD1过表达在人及大鼠PBMCs中均减弱了PF介导的效应，证实了TAZ在不同物种间的核心调控作用。结论：蜂胶黄酮通过TAZ依赖性机制改善慢性骨髓炎，该机制重新平衡Treg/Th17极化并促进细菌清除。这涉及恢复Th17细胞群体，同时抑制其关键效应细胞因子，最终减轻炎症病理并促进骨修复。
### 研究背景与问题
慢性骨髓炎（COM）是一种以持续性骨感染和炎症为特征的难治性疾病，主要由微生物入侵（常见金黄色葡萄球菌）引发，需要长期抗生素治疗和反复手术清创，但治疗失败率在顽固性病例中超过20%。近年研究揭示免疫失调在COM进展中起关键作用，特别是促炎性Th17细胞与免疫抑制性Treg细胞之间的平衡破坏。Th17细胞通过分泌白细胞介素（IL）-17/IL-21加剧炎症性骨破坏，而FOXP3阳性的Treg细胞通过分泌IL-10/IL-2维持免疫耐受。临床研究显示COM患者Th17/Treg比值异常，并与疾病严重程度相关。然而传统免疫调节剂常缺乏特异性。蜂胶黄酮（PF）是蜂胶中提取的活性多酚混合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌和免疫调节特性，但其在COM中的作用机制尚不清楚。转录共激活因子TAZ是Hippo通路关键分子，可调控Th17（RORγt）和Treg（FOXP3）分化相关基因。尽管既往研究（如Ge等，2023）表明TAZ调节COM中Th17/Treg轴，但天然药物对该通路的特异性药理调控尚未探索。本研究的主要创新在于阐明PF作为Hippo-TAZ通路的特异性调节剂，揭示PF解偶联Th17细胞增殖与致病性细胞因子产生的功能可塑性现象。
### 研究内容与结论
研究人员利用体内大鼠COM模型和体外人类及大鼠PBMCs模型，系统研究了PF对COM的免疫调节机制。体内实验将60只Wistar大鼠随机分为对照组、模型组和PF治疗组；体外实验将人及大鼠PBMCs分为对照组、炎症模型组（TGF-β1刺激）、模型+PF组、TEAD1过表达+模型组、TEAD1过表达+模型+PF组。通过Western blot检测TAZ、RORγt、FOXP3蛋白表达，ELISA检测细胞因子水平，流式细胞术分析Th17/Treg比例，EdU实验评估骨膜细胞增殖，CFU计数量化骨组织细菌负荷。结果表明：PF显著上调COM模型中降低的TAZ蛋白表达，减少骨组织细菌负担（p<0.001）；PF增加外周血Th17细胞比例（2.28±0.35% vs 模型1.58±0.31%）并降低Treg比例（1.66±0.27% vs 模型11.5±0.29%），同时上调RORγt、下调FOXP3蛋白水平；PF降低促炎因子IL-17和IL-21，升高抗炎因子IL-10和IL-2；PF促进骨膜细胞增殖。体外实验证实，PF在人及大鼠PBMCs中上调TAZ和RORγt、抑制FOXP3，而TEAD1过表达显著减弱PF的效应，证实TAZ-TEAD1轴的关键作用。该研究发表于《Immunity, Inflammation and Disease》。
### 关键技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：（1）体内模型：60只3月龄Wistar大鼠，分为对照组（假手术）、模型组（股骨髓腔注射甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌MSSA，1×10? CFU/mL）和PF治疗组（模型后口服灌胃PF，10 g/kg，6周）；（2）体外模型：人PBMCs（来自健康供体，Ficoll密度梯度离心）和大鼠PBMCs（来自健康Wistar大鼠），使用TGF-β1（15 ng/mL）诱导炎症状态；（3）检测方法：Western blot分析骨组织中TAZ、RORγt、FOXP3蛋白表达；ELISA检测细胞因子（IL-17、IL-21、IL-2、IL-10）及PBMC中TAZ、RORγt、FOXP3水平；流式细胞术检测外周血Th17（CD4?IL-17A?）和Treg（CD4?Foxp3?）比例；EdU法检测骨膜细胞增殖；CFU计数评估骨组织细菌负荷。所有实验至少三次生物学重复，统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）及Bonferroni事后检验。
### 研究结果
**4.1 蜂胶黄酮增强TAZ蛋白表达并减少细菌负荷**
通过Western blot分析，模型组骨组织中TAZ蛋白相对表达量（1.12±0.07）较对照组（1.84±0.15）显著降低（p<0.001），PF治疗组TAZ表达恢复至1.74±0.12（p<0.001 vs模型）。CFU计数显示模型组细菌负荷为6.82±0.51 Log10 CFU/g，PF治疗组显著降至4.21±0.43 Log10 CFU/g（p<0.001）。
**4.2 蜂胶黄酮调节外周血Th17/Treg细胞动态**
流式细胞术显示，模型组外周血Th17比例（1.58±0.31%）低于对照组（3.89±0.58%，p<0.001），Treg比例（11.5±0.29%）高于对照组（1.87±0.33%，p<0.001）。PF干预部分逆转这些趋势：Th17升至2.28±0.35%（p=0.002 vs模型），Treg降至1.66±0.27%（p<0.001 vs模型）。
**4.3 蜂胶黄酮影响骨组织中转录调节因子RORγt和FOXP3**
Western blot显示模型组RORγt表达（1.06±0.05）低于对照组（1.94±0.16，p<0.001），FOXP3表达（1.85±0.10）高于对照组（1.08±0.02，p<0.001）。PF治疗后RORγt升至1.75±0.14（p<0.001 vs模型），FOXP3降至1.26±0.06（p<0.001 vs模型）。
**4.4 蜂胶黄酮调节骨组织炎症细胞因子表达**
ELISA检测显示，模型组促炎因子IL-17（37.59±3.11 pg/mL）和IL-21（36.38±3.17 pg/mL）升高，抗炎因子IL-10（14.18±2.32 pg/mL）和IL-2（16.46±1.28 pg/mL）降低；PF治疗后IL-17降至22.46±2.39 pg/mL（p<0.001 vs模型），IL-21降至19.57±2.41 pg/mL（p<0.001 vs模型），IL-10升至20.54±3.06 pg/mL（p=0.001 vs模型），IL-2升至28.51±3.04 pg/mL（p<0.001 vs模型）。
**4.5 蜂胶黄酮促进骨膜再生**
EdU实验显示模型组骨膜细胞增殖率显著低于对照组（p<0.001），PF治疗组增殖率恢复至接近对照组水平（p=0.002 vs模型）。
**4.6 TAZ介导的人PBMCs免疫调控**
ELISA检测显示，TGF-β1刺激的人PBMCs中TAZ（1.03±0.01 pg/mL vs 对照1.84±0.16 pg/mL）和RORγt（1.25±0.05 pg/mL vs 1.75±0.14 pg/mL）降低，FOXP3（1.92±0.17 pg/mL vs 1.13±0.05 pg/mL）升高。PF处理逆转这些变化（TAZ: 1.79±0.15, RORγt: 1.83±0.16, FOXP3: 1.25±0.13），而TEAD1过表达显著消除PF效应（TAZ: 1.01±0.01, RORγt: 1.18±0.04, FOXP3: 1.67±0.14；p<0.001 vs PF单用）。
**4.7 大鼠PBMCs中TAZ-TEAD1机制验证**
在大鼠PBMCs中，PF同样上调TAZ和RORγt、抑制FOXP3，TEAD1过表达显著减弱这些效应（p<0.001），证实该机制在大鼠系统中保守。
### 总结与讨论
讨论部分指出，PF治疗伴随Th17细胞增加但效应细胞因子IL-17/IL-21减少，提示一种功能可塑性机制，而非简单免疫抑制。这种解偶联可能有助于在慢性感染中平衡病原体清除与组织保护。PF通过上调TAZ驱动RORγt介导的Th17分化，恢复免疫监视，同时控制过度炎症。TEAD1过表达消除PF效应的机制可能是过量TEAD1未结合TAZ时作为转录抑制子，竞争性占据DNA结合位点，从而抑制RORγt转录。研究局限性包括：大鼠模型不完全模拟人类COM复杂性；未鉴定具体活性黄酮成分；缺乏TAZ敲除/敲低的直接因果证据；未纳入影像学（如micro-CT）、生物力学测试和组织病理学评分等骨修复终点；TEAD1过表达未完全消除PF效应提示可能存在NF-κB或MAPK等非TAZ通路。
### 研究结论
本研究表明，蜂胶黄酮通过调节TAZ-TEAD1信号轴来重新平衡Treg/Th17细胞稳态并促进细菌清除，从而改善慢性骨髓炎。具体而言，PF恢复Th17细胞群体，同时抑制其促炎细胞因子产生，体现了一种精细的免疫调节机制。这些发现将TAZ鉴定为COM的关键治疗靶点，并为蜂胶黄酮作为针对该难治性疾病的新型宿主导向疗法的临床开发提供了强大的机制依据。
