SARS-CoV-2 P.1变异株在K18-hACE2小鼠中加剧的肝脏应激和全身代谢紊乱

《Immunity, Inflammation and Disease》：Exacerbated Hepatic Stress and Systemic Metabolic Disruption Driven by SARS-CoV-2 P.1 Variant in K18-hACE2 Mice

　　

摘要

**引言**
尽管严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）在肺部疾病方面已被广泛研究，但其对代谢器官的影响仍知之甚少，尤其是在实验模型中。

**方法与结果**
在本研究中，研究人员调查了SARS-CoV-2 B.1和P.1变异株感染如何影响K18-hACE2转基因小鼠的代谢组织。两种病毒变异株均在感染后3天引起显著的体重下降和临床恶化，其中P.1变异株的致死率高于B.1。值得注意的是，这种疾病严重程度的增加与肺部病毒载量升高无关。在肝脏和脂肪组织中也检测到病毒RNA，表明这些代谢器官在该模型中允许感染。组织学分析显示，P.1感染小鼠的肝实质结构紊乱，即使在没有大量免疫细胞浸润的情况下也是如此。尽管如此，肝脏促炎细胞因子的表达显著升高，尤其是在P.1感染后。这些变化并未伴随肝纤维化；然而，通过双光子激发荧光（TPEF）成像确认了组织紊乱。与此同时，观察到全身代谢改变，包括酮体生成增加、脂肪组织质量减少、肝糖原耗竭以及葡萄糖稳态改变。这些代谢紊乱很可能导致了观察到的体重下降，并反映了宿主对病毒诱导的能量应激的反应。

**结论**
综上所述，这些发现表明SARS-CoV-2可感染肺部以外的代谢组织，并且P.1变异株在该实验模型中诱导了加剧的肝脏应激和更严重的疾病结局。

**SARS-CoV-2 P.1变异株加剧K18-hACE2小鼠肝脏应激与全身代谢紊乱的机制研究**

**一、研究背景与问题**

由SARS-CoV-2引起的2019冠状病毒病大流行对全球造成了深远影响。尽管病毒对呼吸系统的影响已被广泛研究，但其对代谢器官（如肝脏和脂肪组织）的作用机制尚不明确，尤其在不同变异株之间的差异研究仍属空白。严重COVID-19患者常伴随肥胖、2型糖尿病、心血管疾病和非酒精性脂肪肝等代谢性疾病，提示病毒可能直接或间接干扰宿主代谢稳态。P.1变异株（Gamma株）因其受体结合域突变（K417T、N501Y、E484K）而具有更高的传染性和免疫逃逸能力，在巴西导致更高的住院率和死亡率。然而，B.1（原始巴西株）与P.1变异株在代谢器官中引起的病理和代谢反应是否存在差异，尚未有系统比较。本研究旨在利用K18-hACE2转基因小鼠模型，比较两种变异株对代谢器官的影响，阐明SARS-CoV-2感染如何超出肺部范围、驱动全身代谢紊乱并加剧疾病严重程度。论文发表在《Immunity, Inflammation and Disease》。

**二、主要技术方法**

本研究使用成年雌性K18-hACE2转基因小鼠（购自巴西坎皮纳斯大学多学科生物调查中心，CEMIB），通过鼻内接种5×10⁴ 或1×10⁴ 空斑形成单位的SARS-CoV-2 B.1或P.1变异株。关键方法包括：（1）病毒载量检测：通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和RNAscope原位杂交测定各组织病毒RNA；（2）组织病理学分析：苏木精-伊红（H&E）和过碘酸雪夫（PAS）染色评估组织结构和糖原含量；（3）非线性光学成像：双光子激发荧光（TPEF）显微镜评估实质组织各向异性，二次谐波成像（SHG）定量胶原沉积；（4）代谢参数测定：血糖、血酮体、肝酶（ALT/AST）；（5）基因表达分析：实时定量PCR（qRT-PCR）检测炎症、细胞死亡、糖酵解、脂代谢、线粒体电子传递链及形态相关基因。所有感染实验在巴西里贝朗普雷图医学院BSL-3设施中进行，主实验研究人员对分组保持盲法。

**三、主要研究结果**

**3.1 代谢器官对SARS-CoV-2 B.1和P.1感染具有同等易感性**

通过鼻内接种B.1或P.1变异株，K18-hACE2小鼠在感染后3天即出现约20%体重下降和临床评分恶化。P.1感染组生存率仅12.5%，显著低于B.1组的75%。然而，这种致死率差异并非由于病毒载量增加：两种变异株在肺、肝和脂肪组织中的RNA水平相当（肝脏中B.1: 5.36×10¹⁰ ±0.55×10¹⁰ 拷贝/克；P.1: 5.21×10¹⁰ ±0.42×10¹⁰ 拷贝/克）。此外，仅P.1感染导致肝脏中细胞死亡相关基因（Ldha、Bnip3、Gsdmd）表达上调，而脂肪组织未见此现象。H&E染色显示两种感染均导致肝细胞空泡化及坏死/凋亡形态，但无明显免疫细胞浸润。

**3.2 P.1变异株破坏肝脏实质各向同性并触发促炎反应**

TPEF成像显示，P.1感染后的肝脏实质出现显著结构改变：肝细胞排列方向性增加（各向异性），荧光聚集灶增多，表明正常肝索和血窦网络紊乱。方向性分析（拟合优度R²）证实P.1组肝脏各向同性显著降低。基因表达分析显示，两种变异株均诱导Tnfα表达，但P.1显著上调Il1β、Il6和转录因子Rorc（与Th17免疫应答相关）。此外，P.1感染肝脏中Ifnα表达升高，提示强烈的I型干扰素反应。两种变异株均诱导Mcp1和Stat1表达。这些结果表明P.1变异株引发更强烈的肝脏炎症和结构重塑。

**3.3 SARS-CoV-2感染不诱导肝脏纤维化**

SHG成像定量胶原纤维。肝脏中胶原信号在非感染组（305.3±42.58）、B.1组（288.5±32.12）和P.1组（251.1±21.53）之间无显著差异，表明该模型急性感染期内未出现肝纤维化。相反，P.1感染小鼠肺部胶原沉积显著增加（非感染组597.1±92.24；B.1组892.3±124.9；P.1组1634±271.9），与COVID-19患者肺纤维化报道一致。脂肪组织中，B.1感染导致胶原沉积增加（非感染组15756±510.7；B.1组21121±1061），而P.1组与非感染组相当。

**3.4 SARS-CoV-2感染破坏能量代谢通路**

两种感染组小鼠血酮体水平显著升高，提示脂质氧化增强。B.1感染组血糖降低，而P.1组血糖无显著变化。肝脏PAS染色显示两种变异株均引起肝糖原显著耗竭。糖酵解关键调控因子Pfkfb3在B.1感染后表达下调，提示糖酵解受损。脂肪组织质量减少，且脂肪酸合成酶Fasn表达在两种感染中都显著下调。肝脏中，P.1感染组脂肪酸β-氧化关键酶Acad表达上调。此外，P.1感染导致线粒体电子传递链基因（Sdha、Uqcrc2、Cox6a1）表达上调，但线粒体形态相关基因（Mfn1、Mfn2、Drp1等）无显著变化，表明功能性激活而非结构重塑。这些结果提示P.1感染促进脂质利用转向酮体生成，而B.1感染则倾向于抑制糖酵解。

**四、总结与讨论**

本研究首次系统比较了SARS-CoV-2 B.1与P.1变异株在K18-hACE2小鼠代谢器官中的差异影响。P.1变异株尽管病毒载量与B.1相当，却导致更严重的临床结局、更强的肝脏炎症与细胞死亡信号、更显著的肝脏实质结构紊乱，并驱动代谢向脂质氧化和酮体生成倾斜。这种变异株特异性的宿主反应差异，提示病毒致病性不仅取决于复制能力，更涉及组织内在的免疫代谢重编程。值得注意的是，急性感染期内肝脏未发生纤维化，但肺部出现胶原沉积，提示不同器官对病毒损伤的修复响应具有时间特异性。脂肪组织胶原沉积的变异株差异也反映了组织重塑的复杂性。研究还发现，P.1感染上调线粒体OXPHOS基因但不改变线粒体形态，表明一种转录水平的适应性代谢激活。然而，本研究存在局限性：样本量偏小（尤其P.1组因高致死率导致数量不足）、K18-hACE2模型反映急性重症感染、体重减轻和恶病质样表型可能部分掩盖直接病毒效应。未来研究应采用更低病毒剂量或更长感染周期来解析直接与间接代谢影响。

**研究结论翻译**：
综上所述，这些发现表明SARS-CoV-2可以感染肺部以外的代谢组织，并且P.1变异株在该实验模型中诱导了加剧的肝脏应激和更严重的疾病结局。