四种即时检测(point-of-care)高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus, HR-HPV)检测方法的临床验证——含两种低价态(reduced-valency)检测在资源匮乏地区宫颈癌筛查中的应用

《International Journal of Cancer》：Clinical Validation of Four Point-of-Care High-Risk HPV Assays, Including Two Reduced-Valency Assays, for Cervical Cancer Screening in Low-Resource Settings

　　

摘要：高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus, HR-HPV)持续感染是宫颈癌的必要致病因素，约95%的病例归因于8种致癌潜能最高的HPV型别(16/18/31/33/35/45/52/58)。印度近期开发了数种用于宫颈癌筛查的HPV检测试剂，包括靶向七种或八种致癌HPV型别的低价态(reduced-valency)检测。研究人员评估了四种此类检测的临床准确性与重现性：PathoDetect-HPV-14(14型)、HPV-Q(14型)、Truenat-HR-HPV-Plus(8型)及PathoDetect-HPV-7(7型)。依据VALGENT框架，采用来自阿根廷与哥斯达黎加ESTAMPA研究的1159份宫颈标本进行分析，其中包含97例CIN2+(宫颈上皮内瘤变2级及以上：19例CIN2、72例CIN3及6例癌)。以已确立的参比检测(Cobas-4800及Allplex-HPV-HR)及低价态对照检测进行盲法比较，评估灵敏度(sensitivity)、特异度(specificity)、一致性(agreement)及重复性(repeatability)。结果显示：Truenat-HR-HPV-Plus检测CIN2+的灵敏度为80.4%(95% CI: 71.1–87.8)，特异度为91.5%(95% CI: 89.5–93.2)；满足国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)验证标准，且非劣效于Allplex-HPV-HR-8，CIN2+相对灵敏度为1.03(95% CI: 0.96–1.09)，CIN3+为1.00(95% CI: 0.96–1.04)，CIN2+相对特异度为0.99(95% CI: 0.97–1.00)，CIN3+为0.98(95% CI: 0.97–1.00)；实验室间重复性为93.3%(κ = 0.79)。PathoDetect-HPV-7灵敏度较低(68.1%)，特异度为89.0%。HPV-Q与PathoDetect-HPV-14未达验证标准。本研究系首次对低价态HPV检测进行正式验证，证实Truenat-HR-HPV-Plus具有稳健的临床性能及高于14价检测的特异度，支持其在提升筛查效率、减少不必要转诊方面的应用潜力。

论文解读：低资源环境下宫颈癌筛查用四种即时检测高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus, HR-HPV)试剂盒——含两种低价态(reduced-valency, 即检测型别少于经典14种)检测的临床验证

本研究发表于《International Journal of Cancer》。世界卫生组织(World Health Organization, WHO)推荐HR-HPV检测作为宫颈癌初筛手段，但在中低收入国家(low- and middle-income countries, LMICs)推广受限——商用14价HPV检测成本高、阳性后需分流(triage)致转诊量大，而新兴廉价检测缺乏国际公认标准的临床验证。约95%宫颈癌及相当比例CIN3(宫颈上皮内瘤变3级, cervical intraepithelial neoplasia 3)归因至8种最高致癌潜能HR-HPV型别(16/18/31/33/35/45/52/58)，提示限制检测靶标至这8种(或7种)可在保持合理灵敏度同时提高特异度、降低假阳性转诊，即"低价态检测"思路。2024年IARC(International Agency for Research on Cancer, 国际癌症研究机构)联合专家组制定了适用于低价态HPV检测的改良Meijer标准(IARC criteria)。为此，印度DBT(Department of Biotechnology, 生物技术部)甄选四种本土开发的即时检测(point-of-care, POCT)RT-PCR平台HPV试剂盒——两种14价(PathoDetect-HPV-14、HPV-Q)及两种低价态(PathoDetect-HPV-7检7型:16/18/31/33/45/52/58；Truenat-HR-HPV-Plus检8型:上述7型+35型)——采用VALGENT框架，以ESTAMPA研究拉美标本盲法对比金标准(Cobas-4800、Allplex-HPV-HR)，验证其临床性能与重现性。最终仅Truenat-HR-HPV-Plus满足全部IARC低价态验证标准(相对灵敏度≥90% CIN2+、≥95% CIN3+，相对特异度达标，实验室间一致性>87%、κ≥0.5)，其余三款均未通过。证明经严格验证的8价POCT检测可成为LMICs可靠、具成本效益的筛查选项。

主要关键技术方法：采用ESTAMPA研究(阿根廷布宜诺斯艾利斯及哥斯达黎加圣何塞，筛查44 135名30–64岁女性)生物样本库冻存临床医生采集PreservCyt保存宫颈标本。按VALGENT方案随机抽取1000份筛查标本(含正常及病变各层级)，额外加入71份组织学确诊CIN2+富集标本，最终验证集1059份(含97例CIN2+: 19 CIN2、72 CIN3、6癌)。参比检测为Cobas-4800 HPV(检14型,Roche)及Allplex HPV-HR(检14型,Seegene)；候选四试剂盒分送印度三家实验室盲法检测。建Allplex-HPV-HR-8(限8型阳性判阳)及Allplex-HPV-HR-7(限7型阳性判阳)模拟对照评估低价态检测。以组织病理学(辅以p16免疫染色)CIN2+及CIN3+为疾病终点，计算绝对/相对灵敏度、特异度、95%CI，评估型别一致(Cohen's κ)及实验室间重现性(500例盲法复测)。

研究结果：

4.1 验证用标本特征(Characteristics of the Samples Used for Validation)：最终验证集1059份，筛查人群平均44.8岁、富集组42.5岁；Cobas-4800 HPV阳性率筛查组14.6%、富集组93.0%；CIN2+总体占9.2%(97/1059)，CIN3+占7.4%(78/1059)。各检测HPV阳性率：Cobas-4800(14型)19.8%，Allplex-HPV-HR(14型)21.1%，PathoDetect-HPV-14(14型)24.3%，HPV-Q(14型)15.4%(仅507/1059有效)，Allplex-HPV-HR-8(8型)13.8%，Truenat-HR-HPV-Plus(8型)15.1%，Allplex-HPV-HR-7(7型)12.8%，PathoDetect-HPV-7(7型)16.3%。

4.2 参比及候选检测检出任意CIN2+的绝对灵敏度与特异度(Absolute Sensitivity and Specificity of Reference and Candidate Assays to Detect Any CIN2+)：Cobas-4800灵敏度91.8%(95% CI:84.4–96.4)、特异度87.4%(85.2–89.5)；Allplex-HPV-HR灵敏度88.7%(80.6–94.2)、特异度85.8%(83.4–87.9)。PathoDetect-HPV-14灵敏度78.4%(68.8–86.1)、特异度81.3%(78.7–83.8)，未达标。HPV-Q仅507份有效，灵敏度55.4%(41.5–68.7)、特异度89.6%(86.4–92.2)，性能差。Truenat-HR-HPV-Plus(8型)全份有效，灵敏度80.4%(71.1–87.8)、特异度91.5%(89.5–93.2)。PathoDetect-HPV-7灵敏度68.1%(57.7–77.3)、特异度89.0%(86.8–90.9)，未达IARC低价态灵敏度下限。

4.3 参比及候选检测检出任意CIN3+的绝对灵敏度与特异度(Absolute Sensitivity and Specificity of Reference and Candidate Tests to Detect Any CIN3+)：Cobas-4800灵敏度91.0%(82.4–96.3)、特异度85.8%(83.5–88.0)；Allplex-HPV-HR灵敏度88.5%(79.2–94.6)、特异度84.3%(81.9–86.5)。PathoDetect-HPV-14灵敏度82.1%(71.7–89.8)、特异度80.5%(77.8–82.9)。HPV-Q灵敏度50.0%(34.2–65.8)。Truenat-HR-HPV-Plus灵敏度80.8%(70.3–88.8)、特异度90.1%(88.1–91.9)，6例浸润癌中仅漏检1例HPV39(非8型靶标)。PathoDetect-HPV-7灵敏度72.7%(61.4–82.3)、特异度88.3%(86.1–90.3)。

4.4 候选检测对比参比检测(含低价态模拟参比)的相对灵敏度、特异度及一致性(Relative Sensitivity, Specificity, and Concordance of Candidate Tests Compared to Reference Tests, Including Reduced-Valency Comparators)：Allplex-HPV-HR vs Cobas-4800相对灵敏度CIN2+ 0.97(0.92–1.02)、CIN3+ 0.97(0.92–1.03)，相对特异度均为0.98，符合WHO目标产品概况(WHO Target Product Profile, WHO-TPP)。Truenat-HR-HPV-Plus vs Allplex-HPV-HR-8相对灵敏度CIN2+ 1.03(0.96–1.09)、CIN3+ 1.00(0.96–1.04)，相对特异度CIN2+ 0.99(0.97–1.00)、CIN3+ 0.98(0.97–1.00)，满足IARC低价态验证标准；8型总一致率95.7%(κ=0.82)，HPV16/18一致率97.5%(κ=0.77)。PathoDetect-HPV-7 vs Allplex-HPV-HR-7相对灵敏度CIN2+ 0.93、CIN3+ 0.97，未达IARC要求。PathoDetect-HPV-14 vs Allplex-HPV-HR相对灵敏度CIN2+ 0.88、CIN3+ 0.93，未达Meijer/WHO-TPP标准。HPV-Q相对灵敏度仅0.60(CIN2+)、0.54(CIN3+)，极差。

4.5 验证中各项检测的实验室间重现性评估(Assessment of Interlaboratory Reproducibility of the Tests Under Validation)：Truenat-HR-HPV-Plus总体一致率93.3%(κ=0.79; 95%CI:0.70–0.88)，满足IARC κ≥0.5且一致率>87%标准。PathoDetect-HPV-14一致率63.6%(κ=0.29)，PathoDetect-HPV-7一致率80.1%(κ=0.52，未达κ≥0.5重现性最低要求虽接近)，HPV-Q一致率37.2%(κ=0.01)，均不满足重现性标准。

讨论与结论：本研究全面评估四种印度本土实时荧光定量PCR(real-time PCR, RT-PCR)基POCT HPV检测，含首度依IARC新标准验证低价态检测。两款14价(HIV-Q大量无效结果且灵敏度不足、PathoDetect-HPV-14灵敏度与重现性未达标)均未过验证。PathoDetect-HPV-7缺HPV35且灵敏度不足未达IARC标准，虽特异度尚可重现性有限。唯Truenat-HR-HPV-Plus满足全部IARC非劣效与重现性标准，CIN2+相对灵敏度1.03、CIN3+ 1.00，特异度高于Allplex(14型)与Cobas-4800，可减少不必要转诊；其平台便携、可电池供电、耗材室温存储，适合基层开展，IARC正在印度泰米尔纳德邦农村初级卫生保健中心进行实施性研究。限定至8种最主要致癌型别并优化循环阈值(cycle threshold, Ct) cutoff可在微幅牺牲灵敏度下大幅提高特异度，契合高流行区可持续筛查需求。局限：受控实验室条件，尚待真实世界温湿度稳定性、自取样适用性及内置标本质控(internal control for sample adequacy)完善验证。结论(Conclusion)：本研究为中低收入国家提供可扩展、资源节约型HPV检测验证模型；印度现已拥有经验证之POCT HPV检测，全国推广前须先行扩大规模阶段并严格监测跨情境、跨操作者及不同生产批次之一致性表现。