腹内侧前额叶皮层至下丘脑室旁核的下行单突触环路调控雄性小鼠的社会回避与条件性恐惧行为

《Cell Discovery》：Top-down medial prefrontal cortex-to-hypothalamic paraventricular nucleus circuit regulates social avoidance and conditioned fear in male mice

　　

摘要：威胁加工过程中皮层抑制功能受损会增加个体对应激相关精神障碍的易感性，但其潜在的神经生物学环路尚不清楚。本研究结合单突触病毒示踪、电生理学、在体钙成像及功能操控技术，在小鼠中阐明了一条起源于腹内侧前额叶皮层(vmPFC)谷氨酸能锥体神经元至下丘脑室旁核(PVN)表达促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)神经元的功能特化单突触通路——vmPFCGlu→PVNCRH。研究人员发现，激活内侧前额叶皮层(mPFC)驱动的CRH"起搏细胞(pacemaker cells)"可在PVN局部CRH网络中传播钙信号。该vmPFCGlu→PVNCRH环路过度兴奋可促进持续性社会回避、巩固威胁记忆、促进听觉线索恐惧习得并损害恐惧消退。反之，抑制该环路可选择性减轻社会应激诱导的回避行为。研究结果表明，一条新型下行(top-down)皮层环路特异性调控心理社会应激反应并放大条件性恐惧易感性。

论文解读：腹内侧前额叶皮层—下丘脑室旁核CRH神经元环路在心理社会应激与条件性恐惧中的调控作用

研究背景与立项依据

创伤后应激障碍(PTSD)是一种以持续再体验恐惧记忆、恐惧消退受损及对应激的失调反应为特征的精神疾病，被认为与皮层—皮层下应激环路功能紊乱有关。腹内侧前额叶皮层(vmPFC, ventromedial prefrontal cortex)传统上被认为通过抑制杏仁核依赖的恐惧反应并促进恐惧消退来发挥"下行抑制"作用；而下丘脑—垂体—肾上腺(HPA, hypothalamic–pituitary–adrenal)轴过度活跃则与PVN中促肾上腺皮质激素释放激素(CRH, corticotropin-releasing hormone)神经元慢性高活化相关。既往观点认为mPFC经终纹床核(BNST, bed nucleus of the stria terminalis)等中间核团间接抑制PVN，但mPFC是否存在直接投射至PVN^CRH神经元、及其在威胁/恐惧表型中的确切机制仍不明确。本研究旨在明确mPFC→PVN^CRH单突触通路的解剖学基础与功能，探讨其过度激活是否可模拟PTSD样表型及抑制能否缓解社会应激诱导的回避，从而为应激相关精神病理提供环路水平的解释。本文发表于《Cell Discovery》。

主要关键技术方法

研究人员以雄性C57BL/6J小鼠及CRH-IRES-Cre、Rosa26-pCAG-LoxP-stop-LoxP-tdTomato-P2A-G-IRES-TVA（简称CRH^TVA/G+/+）和Ai14转基因小鼠为实验对象，采用：(1) 狂犬病毒(RV, rabies virus)单突触逆行示踪结合荧光显微光学切片断层扫描(fMOST, fluorescence micro-optical sectioning tomography)及单细胞重建，确认vmPFC^Glu→PVN^CRH单突触连接；(2) 顺向单突触AAV1(anterograde AAV1)示踪验证投射特异性；(3) 离体膜片钳记录光诱发兴奋性突触后电流(EPSC, excitatory postsynaptic current)及脑片钙成像，检测vmPFC末梢激活对PVN^CRH神经元钙信号的驱动效应与"起搏细胞"传播特征；(4) 在体光纤光度记录(fiber photometry)同步监测社会挫败(SD, social defeat)过程中vmPFC输入与PVN^CRH神经元钙动态；(5) 化学遗传学(chemogenetics)——Cre依赖性表达hM3D(Gq)或hM4D(Gi)于接受vmPFC支配的PVN^CRH神经元，经氯氮平-N-氧化物(CNO, Clozapine N-oxide)操控环路活性，结合急性/慢性社会挫败(aSD/CSD, acute/chronic social defeat)、社会接触测试(social interaction test)、条件性恐惧习得与消退范式及血清皮质酮(corticosterone)酶联免疫吸附测定(ELISA)，评估行为表型与HPA轴反应。

研究结果

Pyramidal cells in the vmPFC provide monosynaptic innervation to CRH neurons in the PVN（vmPFC锥体细胞单突触支配PVN的CRH神经元）

通过RV-EnvA-ΔG-EGFP注射至CRH^TVA/G+/+小鼠PVN进行单突触逆行示踪，研究人员发现直接投射至PVN^CRH神经元的输入胞体主要位于vmPFC前边缘皮层(PrL, prelimbic)与下边缘皮层(IL, infralimbic)第Ⅴ层锥体细胞。fMOST成像与单细胞三维重建显示vmPFC锥体细胞轴突分支进入PVN并形成与CRH神经元胞体紧密并置的突触小结。顺向AAV1-Cre-GFP注射vmPFC后，PVN中部分td-Tomato⁺（CRH-Cre;Ai14来源）神经元接收vmPFC输入且其中一部分共标CRH免疫阳性，证实存在vmPFC^Glu→PVN^CRH直接单突触投射，而背内侧前额叶皮层(dmPFC, dorsomedial prefrontal cortex)无此类投射。

vmPFC projection neurons control PVN^CRHneurons by initiating pacemaker cells in the PVN（vmPFC投射神经元通过启动PVN内起搏细胞调控PVN^CRH神经元）

离体膜片钳记录显示，光刺激vmPFC来源轴突末梢可于PVN^CRH神经元诱发显著EPSC（幅值约86.77±16.33 pA）。脑片及在体光纤光度记录表明，激活vmPFC末梢引起PVN^CRH神经元钙信号快速上升并呈现级联放大效应，尤以首次光脉冲后明显，且在应激条件下（而非静息状态）可升高血清皮质酮水平。通过fDio-hM3D(Gq)特异性激活受vmPFC支配的PVN^CRH神经元（即"起搏细胞"），CNO处理后出现起搏细胞内钙骤升并向局部其他CRH神经元经纤维传播，引发PVN^CRH群体钙活动增强及c-Fos大量表达，提示部分PVN^CRH神经元作为起搏节点将vmPFC兴奋性信号放大传递至局部网络。

vmPFC-PVN^CRHcircuit dynamics underlie social defeat-induced fear encoding and stress responses（vmPFC-PVN^CRH环路动态参与社会挫败诱导的恐惧编码与应激反应）

在体同步记录显示，初次急性社会挫败(aSD)攻击时vmPFC输入钙信号短暂下降而PVN^CRH神经元钙信号升高；重复攻击时两者均升高并维持高于基线。次日社会接触测试中，首次接触CD-1小鼠时PVN^CRH神经元仍显著激活，重复接触及退回角落时vmPFC输入活动升高先于PVN激活，提示vmPFC输入参与威胁记忆提取、PVN^CRH参与恐惧记忆巩固。aSD与慢性社会挫败(CSD)均诱导vmPFC输入神经元c-Fos与FosB表达显著上调，并伴CSD小鼠社交互动减少与强迫游泳不动时间增加。

vmPFC-PVN^CRHcircuit mediates the bidirectional control of social avoidance behavior following aSD stress（vmPFC-PVN^CRH环路双向调控aSD应激后的社会回避行为）

化学遗传学激活vmPFC→PVN^CRH环路（hM3D(Gq)+CNO）使经历aSD的小鼠在24小时、7天及30天后均表现社交互动比(SI ratio)降低、在互动区停留时间与进入次数减少、在角落区增多、面对CD-1时僵住(freezing)时间延长，且不影响基础运动与焦虑样行为。反之，预先用hM4D(Gi)+CNO抑制该环路可显著逆转aSD诱导的社交回避与CD-1前僵住时间增加，同样不影响一般活动与焦虑，表明该环路是aSD诱导社会回避的必要介导者，且激活模拟、抑制缓解PTSD样回避表型。

Activation of the vmPFC-PVN^CRHcircuit potentiates fear learning and impairs fear extinction（激活vmPFC-PVN^CRH环路增强恐惧习得并损害恐惧消退）

在听觉线索—电击配对条件性恐惧范式中，激活该环路使小鼠在条件化当天听觉线索(CS, conditioned stimulus)间间隔(ITI, intertrial interval)僵住率提前升高且ITI总僵住时间延长；第2天回忆与第9天消退测试中，CNO组在CS与ITI均维持更高僵住率，消退学习受损——此效应可被糖皮质激素受体拮抗剂米非司酮(mifepristone)部分阻断，提示依赖糖皮质激素受体(GR, glucocorticoid receptor)信号。而抑制该环路不影响恐惧习得、表达或消退。激活该环路所诱导的持久高僵住与SPS&S（单次延长应激加电击, single prolonged stress and foot shock）模型表型相当，表明环路过度激活可模拟PTSD样条件性恐惧固着。

讨论与结论翻译（浓缩自原文Discussion）

本研究揭示了一条从vmPFC谷氨酸能神经元至PVN^CRH神经元的下行单突触兴奋性通路，其直接调控心理应激易感性与小鼠PTSD样表型，重新定义了vmPFC在应激调节中的部分作用并提出应激相关疾病易感性的神经基础。解剖学上，vmPFC第Ⅴ/Ⅵ层锥体细胞轴突终扣直接与PVN^CRH神经元胞体形成单突触联系，部分CRH神经元作为"起搏细胞"启动局部网络兴奋传播，放大应激信号。功能上，该通路在社会心理应激时被激活：初次威胁时PVN^CRH响应占主导，持续应激时vmPFC输入活动升高并先于PVN激活，体现威胁显著性(top-down salience)的皮层编码。人为过度激活该通路可诱导持续性社会回避、促进恐惧习得及损害消退——类似PTSD核心症状；抑制之则选择性缓解社会挫败所致回避而不影响基础条件性恐惧，说明其对心理社会威胁显著性编码具功能特异性。该vmPFC^Glu→PVN^CRH环路为mPFC–HPA轴交互提供了直接兴奋性亚环路的实证，或可成为未来干预适应不良回避行为同时保留适应性恐惧的精准靶标。局限性在于仅使用雄性小鼠，雌性中该通路的功能及性激素调节尚待阐明。