血清外泌体miR-27a-5p有助于甲状旁腺癌与甲状旁腺腺瘤的鉴别诊断并抑制甲状旁腺癌细胞凋亡

《International Journal of Endocrinology》：Exosomal miR-27a-5p Helps Differentiate Parathyroid Carcinoma From Adenoma and Inhibits Apoptosis in Parathyroid Carcinoma Cells

　　

目的：甲状旁腺癌（Parathyroid Carcinoma，PC）与良性甲状旁腺腺瘤（Parathyroid Adenoma，PA）的术前鉴别诊断对其治疗和预后至关重要。既往研究发现血清外泌体中miR-27a-5p在PC与PA间存在差异，但其在大样本中差异表达及在PC进展中的调控作用尚不清楚。本研究旨在探讨血清外泌体miR-27a-5p在PC和PA中的差异表达模式及其与临床病理特征的关系，并进一步在细胞水平研究其对PC细胞的作用。方法：研究人员采用高通量测序检测9例PC和9例PA患者血清外泌体的microRNA（miRNA）谱；采用逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）在29例PC和36例PA患者中验证外泌体miR-27a-5p的差异表达，评估其鉴别PC与PA的诊断效能，并分析其与PC临床病理特征的相关性。通过原代细胞培养获取PC原代细胞，采用miR-27a-5p模拟物（mimic）转染和外泌体混合培养考察外泌体对PC细胞凋亡的影响。通过双荧光素酶报告实验鉴定miR-27a-5p的潜在靶基因PIK3CA。结果：外泌体miR-27a-5p在PC与PA间差异显著，在PC中上调且具有良好的诊断效能；其表达还与PC的T分期相关。miR-27a-5p可抑制PC细胞凋亡，该作用可能与其靶基因PIK3CA有关，但具体机制需进一步探究。结论：血清外泌体miR-27a-5p检测是一种无创液体活检（Liquid Biopsy）方法，可为PC的及时准确识别和诊治提供重要参考。阐明miR-27a-5p在PC进展中的调控机制对改善该肿瘤的预后具有重要意义。

论文解读：血清外泌体miR-27a-5p有助于甲状旁腺癌与甲状旁腺腺瘤的鉴别诊断并抑制甲状旁腺癌细胞凋亡

研究背景与意义

甲状旁腺癌（Parathyroid Carcinoma，PC）是一种罕见的内分泌恶性肿瘤，占原发性甲状旁腺功能亢进症（Primary Hyperparathyroidism，PHPT）的0.5%–5%，预后较差，主要死因为难以控制的高钙血症。目前PC与良性甲状旁腺腺瘤（Parathyroid Adenoma，PA）术前难以区分，缺乏特异性肿瘤标志物及有效的影像学或实验室检查指标，常导致误诊漏诊，错失根治性手术时机；且PC对放化疗不敏感，术后易种植转移。此外，PC发生发展的分子机制尚不明确，晚期缺乏有效靶向治疗。外泌体（Exosome）是直径40–100 nm的脂质双层囊泡，携带miRNA等生物活性物质，在循环中具有稳定性，其包含的肿瘤相关miRNA可作为肿瘤诊断的液体活检（Liquid Biopsy）标志物。研究人员此前发现血清外泌体miR-27a-5p在PC与PA间有差异，本研究进一步扩大样本验证其诊断价值，并探讨其对PC细胞凋亡的调控作用及靶基因，以期为PC早期诊断及潜在靶向治疗提供依据。本文发表于《International Journal of Endocrinology》。

主要关键技术方法

研究人员纳入2022至2024年接受手术的65例PHPT患者（29例PC按WHO 2022标准确诊，36例PA），术前行采集外周血分离血清外泌体（Umibio试剂盒提取，透射电镜Transmission Electron Microscopy/TEM及纳米流式NanoFCM鉴定）。选取其中9例PC与9例PA的外泌体行miRNA高通量测序，其余标本用RT-PCR检测外泌体miR-27a-5p表达并绘制ROC曲线评估诊断效能，分析其与临床病理特征（血钙、PTH、肿瘤大小、T分期、脉管侵犯、淋巴结及远处转移）的相关性。取PC术后组织经胶原酶消化法原代培养甲状旁腺癌细胞（免疫荧光PTH鉴定），分别进行miR-27a-5p mimic转染及PC血清外泌体混合培养，流式细胞术（Annexin V-FITC/PI）检测细胞凋亡率。构建含PIK3CA 3'UTR野生型（WT）及突变型（MUT）载体，在293T细胞中进行双荧光素酶报告实验验证靶向关系。统计分析采用Mann–Whitney U检验、χ²检验及Spearman相关性分析。

研究结果

3.1. Patient Information and Clinicopathologic Characteristics

研究人员收集29例PC（男15，女14，中位年龄55岁）与36例PA（男3，女33，中位49.5岁）。PC组血钙（p=0.0193）、甲状旁腺激素（Parathyroid Hormone，PTH，p=0.0179）及肿瘤最大径（p=0.0037）均显著高于PA组；磷与维生素D水平无显著差异。PC组中T1–T2期22例、T3–T4期7例，伴血管侵犯8例、淋巴结转移6例、远处转移7例。

3.2. Sequencing Analysis of Serum Exosomal miRNAs From PC/PA Patients Showed Significant Differences in miR-27a-5p

研究人员对9例PC与9例PA血清外泌体行miRNA测序，鉴定出4837种miRNA。差异表达分析（p<0.05且倍数变化>2）显示miR-27a-5p显著高表达于PC外泌体中。GO与KEGG富集分析提示差异miRNA靶基因主要富集于黏着斑（Focal adhesion）、MAPK及Wnt信号通路。

3.3. Differential Expression of Exosomal miR-27a-5p in PC/PA, Analysis of Diagnostic Efficacy, and Relationship With the Clinicopathologic Features of PC

扩大样本RT-PCR证实PC组血清外泌体miR-27a-5p相对表达量显著高于PA组（p<0.0001）；7例PC患者术后外泌体miR-27a-5p较术前显著下降（p=0.0469），提示其主要由肿瘤释放。ROC曲线下面积（Area Under the Curve，AUC）为0.7826（95%CI：0.6731–0.8920），优于血钙（AUC=0.6691）与PTH（AUC=0.6710）。miR-27a-5p表达与PC的T分期相关，T3–T4期高于T1–T2期（p<0.05），与淋巴结转移、远处转移、血管侵犯、肿瘤大小、血钙及PTH无显著相关性。

3.4. Exosomal miR-27a-5p Affects PC Cell Apoptosis

研究人员成功原代培养并鉴定PTH阳性的PC细胞。转染miR-27a-5p mimic后细胞内miR-27a-5p表达显著上调，流式细胞术显示细胞凋亡率明显下降（p<0.05），表明miR-27a-5p抑制PC细胞凋亡；外源性添加PC血清外泌体虽上调细胞内miR-27a-5p，但未明显影响凋亡率。

3.5. PIK3CA Is a Target Gene of miR-27a-5p and May Be an Important Target for Its Regulation of PC Cell Apoptosis

生物信息学预测并显示miR-27a-5p种子序列与PIK3CA（Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalytic Subunit Alpha）3'UTR存在结合位点。双荧光素酶实验显示，共转染miR-27a-5p与野生型h-PIK3CA-3UTR-WT组荧光素酶活性显著低于阴性对照（p<0.001），而突变型h-PIK3CA-3UTR-MUT无此抑制效应，证实PIK3CA是miR-27a-5p的直接靶基因，miR-27a-5p可能通过下调PIK3CA参与PI3K-AKT通路调控PC细胞凋亡。

讨论与结论总结

讨论指出，PC术前难鉴别致延误根治术是不良预后的主因，现有生化指标无法区分PC与PA。外泌体miRNA兼具稳定性与特异性，优于循环肿瘤DNA（circulating Tumor DNA，CtDNA）及循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）。本研究证实血清外泌体miR-27a-5p在PC中显著升高，AUC达0.7826，且与T分期相关，可作为PC无创鉴别诊断及进展评估的潜在液体活检标志物；细胞实验首次证明miR-27a-5p通过靶向PIK3CA抑制PC细胞凋亡。研究局限包括样本量较小、未明确抑制凋亡的具体下游通路、缺乏多中心验证及预后随访数据。未来需扩大样本并深入探究miR-27a-5p–PIK3CA–PI3K/AKT轴的具体机制。

结论翻译：血清外泌体miR-27a-5p检测是一种无创液体活检方法，可为PC的及时准确识别和治疗提供重要参考。揭示miR-27a-5p在PC进展中的调控机制对改善该肿瘤目前的预后状况具有重要意义。