双链DNA感受cGAS(cGAS)-STING(STING)免疫信号在大鼠血脑屏障(BBB)共培养模型中的研究

《Cell Biochemistry and Function》：Double-Stranded DNA Sensing cGAS-STING Immune Signaling in a Rat Co-Culture Model of the Blood–Brain Barrier

　　

摘要：双链DNA（来源于病毒、细菌或凋亡细胞等）被环状GMP-AMP合成酶(cGAS)及干扰素基因刺激因子(STING)受体组成的cGAS-STING信号通路所识别。该通路诱导Ⅰ型干扰素反应，激活干扰素刺激基因(ISGs)和促炎细胞因子的转录。大脑虽为免疫特惠部位，但血脑屏障(BBB)在神经退行性疾病中可引发炎症性免疫反应。帕金森病(PD)的特征为α-突触核蛋白寡聚物(αSO)聚集、神经退行性变及线粒体自噬，其可能激活cGAS-STING通路。本研究在大鼠BBB共培养模型中，分别给予α-突触核蛋白单体(αSM)或αSO处理，考察cGAS-STING通路的变化。结果显示，cGAS-STING通路激活不改变屏障完整性及连接蛋白染色，但可诱导脑内皮细胞中干扰素刺激基因Viperin(Viperin, RSAD2)及促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的转录；此外，STING激活可提高星形胶质细胞中Viperin蛋白水平。αSO（而非αSM）处理可降低屏障紧密性，并诱导脑内皮细胞Viperin和TNF-α转录上调；在星形胶质细胞中，αSO处理不仅上调Viperin和TNF-α mRNA水平，还上调白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)。综上所述，BBB共培养模型细胞中的cGAS-STING通路及其下游免疫信号可被激活而不影响屏障完整性；而αSO可破坏BBB完整性并激活脑内皮细胞及星形胶质细胞中的cGAS-STING免疫通路，支持将cGAS-STING作为神经炎症相关疾病的治疗靶点。

论文解读：大鼠血脑屏障共培养模型中双链DNA感受cGAS-STING免疫信号的研究

一、研究背景与意义

先天免疫系统通过模式识别受体(PRR)检测外源及内源性危险信号，其中胞质双链DNA感受器——环状GMP-AMP合成酶(cGAS, cyclic GMP-AMP synthase)结合双链DNA后催化产生2′3′-环鸟苷酸-腺苷酸(cGAMP)，激活内质网上的干扰素基因刺激因子(STING, stimulator of interferon genes)，进而通过TBK1-IRF3轴诱导Ⅰ型干扰素及干扰素刺激基因(ISGs, interferon-stimulated genes，如Viperin)，并通过NF-κB(nuclear factor κB)轴诱导促炎细胞因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6）。cGAS-STING通路已被证实参与多种自身免疫病、神经系统疾病及脑血管病，但在构成血脑屏障(BBB, blood–brain barrier)的大鼠脑微血管内皮细胞(BEC, brain endothelial cell)及相关细胞（周细胞pericyte、星形胶质细胞astrocyte, AC）中的表达与功能尚未明确。帕金森病(PD, Parkinson's disease)以脑内α-突触核蛋白寡聚物(αSO, α-synuclein oligomer)聚集为典型特征，αSO可致线粒体损伤并使线粒体DNA(mtDNA)泄漏入胞质，理论上可激活cGAS-STING通路；且有报道显示α-突触核蛋白过表达引起BBB渗漏。因此，研究人员旨在大鼠BBB共培养模型中阐明：(1)cGAS-STING通路在各BBB细胞中的表达及激活后对屏障功能与免疫信号的影响；(2)αSM(α-synuclein monomer)与αSO处理对BBB完整性及cGAS-STING通路的影响，以探讨cGAS-STING作为神经炎症治疗靶点的潜力。该论文发表于《Cell Biochemistry and Function》。

二、主要关键技术方法概述

研究人员建立原代大鼠脑微血管内皮细胞(RBEC)、周细胞(RPC)与大鼠星形胶质细胞(RAC)的非接触共培养BBB模型，通过经内皮电阻(TEER, transendothelial electrical resistance)及荧光探针（Na-荧光素SF、FITC-70 kDa葡聚糖FITC70）通透性评估屏障功能；以STING激动剂cAIMP(3′3′-cyclic AMP-IMP, 50 ng/μL)直接激活cGAS-STING通路，以重组αSM及αSO(1 μM)处理；采用免疫荧光染色观察紧密连接蛋白(claudin-5、β-catenin)；采用Western blot检测STING及Viperin蛋白；采用siRNA敲低STING验证通路特异性；采用RT-qPCR检测Viperin、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平（以β-actin为内参）；采用CellTiter-Blue检测细胞活力；数据统计采用单因素ANOVA及Bonferroni或Tukey多重比较检验。

三、研究结果

3.1 The Co-Culture Model of the Rat Blood–Brain Barrier（大鼠血脑屏障共培养模型的表征）

研究人员将原代大鼠BEC接种于包被纤连蛋白/IV型胶原的Transwell上室，与下室培养的星形胶质细胞建立非接触共培养BBB模型。测得TEER达618.7 ± 51.2 Ω×cm²，SF表观渗透系数(P_app)为6.3 ± 0.6 × 10^?6cm/s，FITC70 P_app为0.220 ± 0.106 × 10^?6cm/s，免疫荧光显示BEC间形成连续带状claudin-5及β-catenin染色。结果表明该共培养模型具备高阻抗、低通透性及完整紧密连接，符合功能性BBB模型标准。

3.2 The Effect of the Activated cGAS-STING Pathway on Blood–Brain Barrier Integrity（激活cGAS-STING通路对血脑屏障完整性的影响）

研究人员用cAIMP(50 ng/μL)处理BBB共培养模型2、6、12 h，细胞活力无变化；TEER值（对照组约454.3 ± 85.3 Ω×cm²）及各时间点cAIMP处理组间无显著差异；SF通透性亦未被cAIMP改变；免疫荧光显示claudin-5与β-catenin在cAIMP处理后仍呈连续膜带状分布，无中断。结论：短期cGAS-STING通路激活不影响BBB共培养模型屏障完整性、通透性及对紧密连接蛋白的分布。

3.3 The Effect of the Activated cGAS-STING Pathway on Signaling of the Cells of the Blood–Brain Barrier（激活cGAS-STING通路对血脑屏障细胞信号分子的影响）

Western blot显示STING蛋白在BEC、周细胞、星形胶质细胞中均有表达，cAIMP处理2 h不改变其蛋白量；Viperin蛋白在BEC和周细胞中可检出，星形胶质细胞中基线极低，cAIMP处理使BEC和星形胶质细胞Viperin蛋白上调（周细胞略降）。BEC中STING部分敲低后Viperin基线降低，cAIMP仍可诱导其上调。RT-qPCR显示共培养中BEC经cAIMP处理2 h后Viperin和TNF-α mRNA显著升高，6 h回落但仍高于对照；IL-1β与IL-6 mRNA无显著变化。ELISA未检测到培养上清中TNF-α分泌量变化。结论：cGAS-STING激活可在BEC和星形胶质细胞中诱导ISG（Viperin）及部分促炎因子（TNF-α）转录上调，但不引起广泛细胞因子风暴，且此免疫激活独立于屏障破坏。

3.4 The Effect of α-Synuclein Oligomer Treatment on Barrier Integrity and Proinflammatory Cytokine Genes（α-突触核蛋白寡聚物处理对屏障完整性及促炎细胞因子基因的影响）

αSM或αSO(1 μM)处理6 h对BEC单层活力无影响。αSO处理显著降低BBB共培养模型TEER值，αSM无此作用。αSO（而非αSM）显著上调BEC和星形胶质细胞中Viperin及TNF-α mRNA；此外，星形胶质细胞中IL-1β与IL-6 mRNA也显著上调，BEC中仅见趋势而无显著性。αSO处理还引起BEC中线粒体形态学改变。结论：病理性αSO可破坏BBB屏障功能，并在BEC和星形胶质细胞中激活cGAS-STING通路下游ISG及促炎细胞因子表达，且星形胶质细胞炎症反应更为广泛。

四、讨论与结论总结

研究人员讨论指出，本研究首次在大鼠BBB三种主要细胞（BEC、周细胞、星形胶质细胞）中检测到STING蛋白表达，并证实cAIMP可通过STING依赖方式诱导Viperin表达。与某些外周屏障不同，BBB中短期cGAS-STING激活不损害屏障完整性，提示BEC中该通路主要介导免疫信号而非直接调控通透性。αSO引起线粒体损伤致mtDNA泄漏可能是cGAS-STING激活的机制之一，且αSO明显破坏BBB紧密性并协同激活BEC及星形胶质细胞cGAS-STING免疫应答，支持其在PD相关神经炎症及血管病变中的作用。局限性包括STING敲低效率有限及未直接检测胞质mtDNA-cGAS结合。

研究结论（译自原文Conclusion）：

cGAS-STING通路可在血脑屏障中被激活，并在脑内皮细胞中诱导免疫信号通路而不影响BBB完整性。寡聚α-突触核蛋白可破坏屏障完整性并激活脑内皮细胞及星形胶质细胞中的cGAS-STING通路。这些在BBB共培养细胞中的结果支持将cGAS-STING作为神经炎症性疾病治疗靶点的设想。