《International Journal of Genomics》：An Epithelial–Mesenchymal Transition–Driven Transcriptional Index Stratifies Immunosuppression and Therapeutic Resistance in Bone Malignancies
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摘要：骨恶性肿瘤（主要指骨肉瘤、尤文氏肉瘤及骨巨细胞瘤）侵袭性临床病程及有限的治疗手段很大程度上由其复杂的肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)所决定。为解析此种细胞异质性并筛选可行的预后标志物，研究人员整合了多个骨癌队列的单细胞
摘要：骨恶性肿瘤（主要指骨肉瘤、尤文氏肉瘤及骨巨细胞瘤）侵袭性临床病程及有限的治疗手段很大程度上由其复杂的肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)所决定。为解析此种细胞异质性并筛选可行的预后标志物，研究人员整合了多个骨癌队列的单细胞及批量转录组(Bulk Transcriptomic)数据。单细胞(scRNA-seq)分析揭示了复杂的TME层级结构；对恶性细胞区室进行非负矩阵分解(Non-negative Matrix Factorization, NMF)分析，分离出一个由上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)显著驱动的特异性转录元程序(Metaprogram, MP)。提取调控该EMT轴的关键基因后，研究人员采用CoxBoost及随机生存森林(Random Survival Forest, RSF)模型构建并精简出一个由八个基因组成的预后框架，命名为骨评分(bone score)。在三个独立患者队列中，升高的bone score始终与显著缩短的总生存期(Overall Survival, OS)相关。除作为生存指标外，该特征直接对应于免疫抑制表型——表现为免疫细胞浸润减少及免疫检查点信号减弱，并能预测对九种化疗药物的广泛耐药性。综上，这一基于机器学习的指数提供了一个精细且具生物学依据的工具，用于风险分层，捕捉驱动骨癌治疗失败的肿瘤-基质交互对话(tumor-stroma crosstalk)。
论文解读：An Epithelial–Mesenchymal Transition–Driven Transcriptional Index Stratifies Immunosuppression and Therapeutic Resistance in Bone Malignancies
一、研究背景与意义
原发性骨恶性肿瘤（主要为骨肉瘤Osteosarcoma、尤文氏肉瘤Ewing's sarcoma和骨巨细胞瘤Giant Cell Tumor of Bone, GCTB）在儿科及青少年人群中致死率极高。局限性病灶虽可施治，但转移或复发患者5年总生存率低于30%，现有强化多模式治疗方案遇瓶颈。传统观点认为系化疗药物失效，实则源于未能系统解析肿瘤内部显著的异质性及具保护作用的肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)如何介导治疗逃逸。上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)轴是适应性耐药与转移播散的核心，虽有单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)开始描绘骨癌亚克隆架构，但EMT驱动转录元程序(Metaprogram, MP)的具体临床印迹不明，且缺乏将复杂单细胞EMT特征转化为临床可操作分层工具的生物标志物。本研究旨在桥接此转化鸿沟，发表于《International Journal of Genomics》。
二、主要关键技术方法
研究人员下载GEO数据库骨癌scRNA-seq数据集（GSE168664、GSE198896含尤文氏肉瘤/骨肉瘤/GCTB、GSE212341）及Bulk RNA-seq数据集（TARGET骨肉瘤库、GEO: GSE21257、GSE39055）。使用R包Seurat处理scRNA-seq，InferCNV界定恶性细胞。采用非负矩阵分解(Non-negative Matrix Factorization, NMF; GeneNMF包)对恶性细胞表达矩阵分解以识别转录MP，选取与Hallmark EMT基因集最相关的MP3且相关系数>0.5的基因，并与恶性细胞上调基因取交集。对候选基因先做单变量Cox回归，再用CoxBoost降维，最终由随机生存森林(Random Survival Forest, RSF)筛选出8个基因构建"bone score"。使用ESTIMATE算法评估TME分数，TIMER预测免疫细胞浸润，9种免疫治疗特征(Immunotherapeutic Signatures, 如CYT、IFNγIS等)评估免疫疗效，R包pRRophetic预测药物敏感性，以p≤0.05为显著差异。
三、研究结果
3.1. Single-Cell Transcriptomic Landscape of Bone Cancer（骨癌单细胞转录组图谱）
研究人员对三个骨癌scRNA-seq数据集进行无监督聚类，鉴定出B/浆细胞、周期细胞、内皮细胞、上皮细胞、恶性细胞、间充质细胞、髓系细胞及T细胞共8大主要类型，进一步细分得到17个不同minor cell populations，提供了骨癌TME的高分辨率细胞图谱。
3.2. Identification of EMT-Related Transcriptional Program in Malignant Cells（恶性细胞中EMT相关转录程序的识别）
为探究恶性细胞转录异质性，对恶性细胞表达矩阵行NMF分析，依据共表相关系数与残差平方和确定8个稳定转录MP。其中MP3与恶性细胞群EMT评分相关性最强，表明MP3代表骨癌中EMT相关的转录程序。提取与MP3显著相关(R>0.5)且在恶性细胞中上调的基因共239个待后续分析。
3.3. Development and Validation of a Bone Score Prognostic Model（Bone Score预后模型的建立与验证）
从上述239基因中，单变量Cox回归筛出20个与总生存显著相关的基因，CoxBoost进一步保留10个，RSF最终确定8个核心基因（COL5A2、FKBP11、S100A13、RPS8、CRIP1、RPL7、BTG3、CRNDE）构建bone score。将该8基因特征映射到Bulk RNA数据集，生存分析显示：在TARGET训练队列及GSE21257、GSE39055两个独立验证队列中，高bone score均显著对应更差的总生存期，证实bone score是骨癌稳健的预后生物标志物。
3.4. Functional Annotation of Bone Score（Bone Score的功能注释）
对高低bone score组差异表达基因行KEGG通路富集，高分组显著富集于抗原加工呈递、ECM-受体互作、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、白细胞跨内皮迁移、PI3K-Akt信号通路、TGF-beta信号通路、Th1/Th2细胞分化、Wnt信号通路及p53信号通路等多条肿瘤相关通路。
3.5. Bone Score Predicts Drug Sensitivity（Bone Score预测药物敏感性）
利用pRRophetic包默认药库筛选，高bone score与对9种药物（navitoclax、olaparib、Eg5_9814、TAF1_5496、ULK1_4989、AZD4547、acetalax、dihydrorotenone及sepantronium bromide）敏感性降低显著相关，提示高bone score患者可能从此类化疗中获益较少。
3.6. Bone Score Correlates With Immune Microenvironment Features（Bone Score与免疫微环境特征的相关性）
ESTIMATE分析示高bone score关联更低基质分数(stromal score)、免疫分数(immune score)及ESTIMATE分数，但肿瘤纯度(tumor purity)更高。TIMER分析一致显示高分组中B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞及树突状细胞浸润水平显著降低，表征免疫排斥/抑制表型。
3.7. Bone Score Predicts Immunotherapeutic Response（Bone Score预测免疫治疗反应）
分析9种既定免疫治疗特征(CYT, IFNγIS, chemokineIS, RIR, ICBnetIS, AyersExpIS, RohIS, DavoliIS, GEP)，所有特征在高bone score组得分均显著更低，表明高bone score患者可能对免疫检查点阻断(Immune Checkpoint Blockade, ICB)治疗响应率低。
四、讨论与结论总结
研究人员指出，本研究提供了一个量化骨恶性肿瘤侵袭性的统一生物学指数。基于scRNA-seq解析TME并结合NMF分离EMT驱动MP，聚焦其关联基因构建的bone score捕获了骨癌细胞异质性、免疫排斥及广泛治疗耐药间的核心联系。功能富集证实高bone score与PI3K-Akt、TGF-beta、Wnt等促癌通路相关，且与免疫抑制TME（免疫细胞浸润少、免疫治疗特征低）相符，可借此甄别不宜盲目行ICB治疗的患者以避免毒性及延误；药物敏感性分析亦为指导个性化化疗提供依据。局限性在于合并三种不同起源骨肿瘤可能掩盖疾病特异性差异、基于回顾性公共数据需前瞻性临床试验验证、EMT-bone score-免疫抑制间具体功能机制需实验验证、且仅靠转录组未整合基因组与蛋白组。结论：该EMT驱动转录指数提供了一种评估骨恶性肿瘤免疫抑制的生物视角，虽尚未达临床即时应用标准，但为未来前瞻性风险分层及探索标准治疗无效者的替代联合疗法奠定了基础。
