《Drug Development Research》：Tramiprosate, the Active Agent of ALZ-801, Modulates Amyloidogenic APP Processing and Tau Phosphorylation in a Cellular Model of Alzheimer's Disease
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摘要：ALZ-801是曲普瑞素（Tramiprosate）的缬氨酸偶联前药，近期作为潜在阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease，AD）修饰疗法在III期临床试验中接受评估。曲普瑞素可减少β-淀粉样蛋白（Amyloid β，Aβ）单体错误折叠并抑制
摘要：ALZ-801是曲普瑞素（Tramiprosate）的缬氨酸偶联前药，近期作为潜在阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease，AD）修饰疗法在III期临床试验中接受评估。曲普瑞素可减少β-淀粉样蛋白（Amyloid β，Aβ）单体错误折叠并抑制寡聚体形成。本研究以N2a-APPSwe细胞系作为AD细胞模型，探讨曲普瑞素对淀粉样前体蛋白（Amyloid Precursor Protein，APP）淀粉样生成加工及Tau蛋白磷酸化的影响。结果显示，曲普瑞素以剂量依赖性方式降低上清液中Aβ40和Aβ42水平，且不影响细胞活力；在该细胞模型中，曲普瑞素还降低APP、β位点APP裂解酶1（β-site APP Cleaving Enzyme 1，BACE1）及早老素1 C端片段（Presenilin 1 C-terminal Fragment，PS1-CTF）水平，表明曲普瑞素可在多步骤调控APP淀粉样生成加工从而减少Aβ产生。此外，曲普瑞素以剂量依赖性方式降低Ser202/Thr205及Ser396/Ser404位点的Tau磷酸化水平，总Tau蛋白水平无变化；糖原合成酶激酶-3β（Glycogen Synthase Kinase-3β，GSK-3β）在Ser9位点磷酸化水平升高而总GSK-3β水平不变，提示GSK-3β抑制是上述位点Tau磷酸化降低的机制基础。综上，曲普瑞素对APP淀粉样生成加工及Tau磷酸化的双重作用揭示其潜在AD疾病修饰价值。
论文解读：曲普瑞素（Tramiprosate）在阿尔茨海默病细胞模型中调节淀粉样前体蛋白（APP）的淀粉样生成加工及Tau蛋白磷酸化
本研究发表于《Drug Development Research》。阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease，AD）以细胞外Aβ斑块和神经元内神经原纤维缠结（Neurofibrillary Tangles，NFTs，由微管相关Tau蛋白过度磷酸化形成）为核心病理特征。Aβ由APP经β分泌酶（BACE1）和γ分泌酶（含催化亚基Presenilin 1，PS1）连续切割产生，可溶性Aβ寡聚体被认为是上游致病因子并可促进Tau过度磷酸化。现有FDA批准药物仅对症缓解，疾病修饰疗法仍在探索中。抗Aβ单抗（如Lecanemab、Donanemab）虽可降 amyloid负荷但需静脉给药且存在淀粉样蛋白相关成像异常（Amyloid-Related Imaging Abnormalities，ARIA）风险。曲普瑞素（Tramiprosate，3-氨基-1-丙磺酸，3-APS）作为糖胺聚糖模拟物可结合Aβ42并抑制其寡聚化和纤维化，其前药ALZ-801旨在改善药代与胃肠耐受。既往研究表明曲普瑞素可降低转基因小鼠脑内Aβ负荷，但对APP加工通路及Tau磷酸化的细胞水平机制尚未明确，且曾有研究提示其可能促进Tau聚集，故需系统评估其对AD双核心病理的作用。本研究首次在N2a-APPSwe细胞模型中探究曲普瑞素对淀粉样生成APP加工及Tau磷酸化的影响及分子机制。
主要关键技术方法：采用稳定过表达人APP695瑞典突变（K595N/M596L，使β分泌酶切增多、Aβ升高并可促Tau高磷酸化）的小鼠神经母细胞瘤N2a-APPSwe细胞为AD细胞模型。以MTT法检测细胞活力确定给药浓度（100 μM和500 μM处理24 h）；夹心ELISA定量上清Aβ40和Aβ42；Western Blot检测全细胞裂解液中APP、α分泌酶（ADAM10）、BACE1、PS1 C端片段（PS1-CTF）、APP C端片段（APP-CTFα/C83和APP-CTFβ/C99）、总Tau及磷酸化Tau（Ser202/Thr205用AT8抗体，Ser262，Ser396/Ser404用PHF-1抗体）、GSK-3β及其Ser9磷酸化、Akt及其Ser473磷酸化、蛋白磷酸酶2A催化亚基（PP2Ac）及其Tyr307磷酸化、蛋白磷酸酶1α（PP1α）；数据以β-actin归一化，One-way ANOVA及Dunnett事后检验分析。
3 Results（结果）
3.1 Viability of N2a-APPSwe Cells After Treatment With Tramiprosate（曲普瑞素处理后N2a-APPSwe细胞的活力）：MTT实验显示50–500 μM曲普瑞素处理24 h对细胞活力无显著影响，750 μM和1000 μM则显著降低活力，因此后续实验选用≤500 μM浓度。
3.2 Tramiprosate Decreases the Levels of Aβ40 and Aβ42 in N2a-APPSwe Cells（曲普瑞素降低N2a-APPSwe细胞上清Aβ40和Aβ42水平）：夹心ELISA显示100 μM和500 μM曲普瑞素分别使Aβ40降低16%（不显著）和27%（显著），使Aβ42分别显著降低22%和51%，表明曲普瑞素剂量依赖性抑制Aβ分泌，对Aβ42抑制作用更强。
3.3 Tramiprosate Modulates the Amyloidogenic Pathway in N2a-APPSwe Cells（曲普瑞素调节N2a-APPSwe细胞淀粉样生成通路）：Western Blot显示500 μM曲普瑞素显著降低全长APP（约27%）及BACE1（约34%）、PS1-CTF（约32%）水平，ADAM10水平无显著变化；APP-CTFα（C83）和APP-CTFβ（C99）水平亦无显著改变。表明曲普瑞素通过降低APP可用量、下调BACE1及影响γ分泌酶复合物组分（PS1-CTF减少提示复合体组装/稳定性/周转改变）而非直接影响γ分泌酶对CTF的加工，共同导致Aβ生成减少。
3.4 Tramiprosate Reduces Tau Phosphorylation in N2a-APPSwe Cells by Modulating GSK-3β Phosphorylation（曲普瑞素通过调节GSK-3β磷酸化降低N2a-APPSwe细胞Tau磷酸化）：总Tau水平不变，100 μM和500 μM曲普瑞素分别使AT8阳性（Ser202/Thr205）p-Tau降低30%和53%（均显著），使PHF-1阳性（Ser396/Ser404）p-Tau分别降低16%（不显著）和25%（显著），100 μM使Ser262 p-Tau显著降低37%而500 μM无显著变化。机制上，500 μM曲普瑞素使GSK-3β Ser9磷酸化显著升高24%（抑制性修饰），总GSK-3β、总Akt及Ser473磷酸化Akt、PP2Ac Tyr307磷酸化及总量、PP1α均无明显变化，提示曲普瑞素通过Akt非依赖途径增强GSK-3β Ser9磷酸化从而抑制其活性，减少特定位点Tau磷酸化；Ser262位点的双相反应提示位点特异性调控及高浓度的代偿/脱靶效应。
4 Discussion（讨论与结论翻译）：AD是一种进行性神经退行性疾病，目前对症药物无法延缓病程，近期FDA批准的抗Aβ单抗需静脉给药且有ARIA风险。曲普瑞素（3-氨基-1-丙磺酸/高牛磺酸）为口服小分子，可通过血脑屏障结合可溶性Aβ并阻止其错误折叠和寡聚化，不结合纤维态Aβ故未引起ARIA；早期III期试验未达主要终点但ApoE ε4纯合子有潜在获益，其前药ALZ-801的III期试验在轻度认知损害受试者中显示疗效。本研究首次在N2a-APPSwe细胞中证明曲普瑞素降低Aβ40/Aβ42分泌，并下调APP、BACE1及PS1-CTF水平但不影响γ分泌酶对APP-CTF的加工，提示其对淀粉样生成通路有多点上游调节作用。同时曲普瑞素剂量依赖性降低GSK-3β依赖位点（Ser202/Thr205、Ser396/Ser404）的Tau磷酸化，机制为增加GSK-3β Ser9抑制性磷酸化且非经Akt通路，Ser262呈浓度双相变化反映位点特异性调控。与既往在Tau转染HEK293/SH-SY5Y细胞中促Tau聚集的报道差异可能源于细胞模型与条件不同。结论：曲普瑞素在N2a-APPSwe细胞中通过抑制APP淀粉样生成加工伴发Tau磷酸化降低，提示其可同时作用于AD两大核心病理机制，具有双重潜在疾病修饰效应；但N2a-APPSwe模型不能完全模拟AD复杂性，需在更接近生理的模型中进一步验证转化意义。
