《Ecology and Evolution》：Hemoglobin Digestion Genes Are Conserved in Lizard-Infective Plasmodium Species With Different Host Cellular Niches
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在脊椎动物宿主中，疟疾寄生虫通常栖息于红细胞内，利用细胞中丰富的血红蛋白作为营养来源。血红蛋白消化的副产物是游离血红素，寄生虫通过将其转化为棕色结晶即疟色素（hemozoin）进行解毒。疟色素是疟原虫感染的标志，该酶促途径在哺乳动物疟原虫中已有充分研究。尽管野
在脊椎动物宿主中，疟疾寄生虫通常栖息于红细胞内，利用细胞中丰富的血红蛋白作为营养来源。血红蛋白消化的副产物是游离血红素，寄生虫通过将其转化为棕色结晶即疟色素（hemozoin）进行解毒。疟色素是疟原虫感染的标志，该酶促途径在哺乳动物疟原虫中已有充分研究。尽管野生动物疟原虫（尤其是感染鸟类和蜥蜴的物种）与哺乳动物疟原虫存在进化亲缘关系，但相关研究不足，其广阔的遗传多样性仍有待探索。危害疟原虫（Plasmodium floridense）、嗜蓝疟原虫（Plasmodium azurophilum）和白细胞疟原虫（Plasmodium leucocytica）感染加勒比海岛屿的安乐蜥，包括萨巴岛特有的安乐蜥。与其他疟原虫类似，P. floridense感染红细胞并产生疟色素。P. azurophilum也感染红细胞，但其姐妹种P. leucocytica感染白细胞，这在疟原虫中不典型，代表其向新细胞生态位的扩展。这三种寄生虫中的两种（P. azurophilum和P. leucocytica）不产生疟色素，似乎已进化出替代的血红蛋白消化机制以获取营养。为探究此问题，研究人员从感染萨巴安乐蜥的血液中组装寄生虫转录组，并分析血红蛋白消化转录本。转录组结果表明，三种蜥蜴寄生虫均转录参与经典血红蛋白消化途径的基因。这是首次证据表明这些寄生虫拥有与特征较好的哺乳动物疟原虫相同的消化酶基因，说明该途径在疟原虫系统发育树中保守。然而，有证据表明三种蜥蜴感染型物种中部分蛋白质存在选择压力变化，这些基因相对于其他疟原虫物种可能功能重要性降低。由于这些基因尚未成为假基因，因此仍存在替代假说，即这些基因在疟疾寄生虫生物学中可能发挥其他作用。
疟疾是由疟原虫引起的全球性健康威胁，2022年估计有2.49亿病例，造成超过60万人死亡。世界卫生组织推荐使用以青蒿素为基础的联合疗法治疗疟疾，但多药耐药性的出现威胁其疗效。疟原虫无性阶段的两个标志性特征包括入侵脊椎动物红细胞以及产生疟色素作为宿主血红蛋白消化的副产物。血红蛋白是人类红细胞中最丰富的蛋白质，占细胞质总量的95%。疟原虫进化出利用这一丰富营养源的代谢途径，例如恶性疟原虫可消化宿主细胞中60%至80%的血红蛋白。血红蛋白消化包括三个主要步骤：宿主血红蛋白的输入、分解为寡肽、以及进一步分解为氨基酸。该途径对于理解寄生虫生物学和药物抗性至关重要，但目前研究仅限于哺乳动物感染型疟原虫。
与五种可感染人类的疟原虫相比，全球有超过100种已描述的疟原虫以蜥蜴为脊椎动物宿主。由于哺乳动物疟原虫可能起源于爬行动物（鸟类、蜥蜴）血孢子虫祖先，对这群多样化寄生虫的采样有助于准确重建哺乳动物和非哺乳动物疟疾的性状演化。然而，蜥蜴感染型疟原虫的基因组多样性仍未被探索。危害疟原虫、嗜蓝疟原虫和白细胞疟原虫感染加勒比海岛屿及周边大陆的安乐蜥，包括萨巴岛的安氏安乐蜥。单一蜥蜴宿主可同时感染一种、两种甚至全部三种寄生虫，这与其独特的细胞内生态位分配有关。P. floridense感染红细胞并产生疟色素；P. azurophilum感染红细胞但不产生可检测到的疟色素；P. leucocytica则感染白细胞，完全不依赖血红蛋白代谢。由于这些独特表型，P. azurophilum和P. leucocytica似乎已进化出典型的血红蛋白消化途径的替代方案以获取氨基酸。此外，非哺乳动物红细胞为有核细胞且具转录活性，可能为栖息其中的疟原虫提供截然不同的环境。研究人员因此推测这些寄生虫要么丢失了该途径的相关基因，要么这些基因在血红蛋白消化之外具有其他用途，可能与细胞生态位分配相关。
该研究发表于《Ecology and Evolution》，研究人员利用萨巴岛野外采集的安乐蜥血液样本，通过转录组学和选择分析来检验上述假设。由于目前尚无蜥蜴感染型疟原虫的全基因组序列，该研究为首次证据表明这些基因在疟原虫系统发育树中保守存在。
研究人员采用的关键技术方法主要包括：野外采集萨巴岛安氏安乐蜥血液样本，使用RNeasy Protect Animal Blood Tubes保存用于RNA提取；通过Trinity进行从头转录组组装，利用ContamFinder过滤宿主污染；表达量计算通过RSEM和Bowtie2完成，DESeq2用于差异表达分析；采用CIBERSORTx进行基因表达反卷积分析，结合Tebben等人发表的疟原虫参考数据集估计寄生虫生活史阶段组成；选择压力分析使用HyPhy中的RELAX工具检测dN/dS比率变化；通过DIAMOND在巴贝斯虫、泰勒虫和弓形虫参考蛋白质组中搜索潜在直系同源蛋白；使用ColabFold和AlphaFold2预测蛋白质结构，并通过ChimeraX进行结构比对。
研究结果部分，"严格过滤提高宿主污染野外样本的寄生虫转录组组装质量"：研究人员从野外分离的蜥蜴血液样本中从头组装了元转录组，包含248,849条contigs。使用ContamFinder过滤后，三种寄生虫各自的元转录组 contig数量降至2,744至2,791条，平均长度约870 bp，N50值约1,000 bp，GC含量符合预期。BUSCO分析表明，过滤后的组装质量显著提高，寄生虫单拷贝基因比例增加且重复率为0%，但相对于疟原虫参考数据库仅约30%完整度，这可能源于野外样本的宿主污染、小样本量及RNA降解。过滤后的组装仍含有少量脊椎动物单拷贝基因，推测源于寄生虫与宿主序列的部分重叠。
"转录组为样本特征分析提供更多洞见"：研究人员将样本reads比对回过滤后的寄生虫元转录组进行表达量计算，以表征每个蜥蜴样本。转录组序列数据显示，部分蜥蜴血液样本存在肉眼未检出的疟原虫感染，且14只感染蜥蜴中有9只存在混合感染而非单一感染。寄生虫血症较低，大多数样本感染细胞比例低于2%。由于野外样本的局限性，寄生虫未经实验同步化，样本包含混合生活史阶段。研究人员采用CIBERSORTx进行基因表达反卷积，使用Tebben等人发表的疟原虫参考数据集估计各样本中寄生虫生活史阶段的相对丰度。估计结果显示，虽然样本为混合阶段，但血红蛋白消化阶段（营养体trophozoite）在各样本中相对丰度较高，暗示无生活史阶段在其他组织中隔离。值得注意的是，P. azurophilum感染样本中雌性配子体比例异常高，而雄性配子体极少。
"整体转录表达因寄生虫物种而异"：主成分分析显示，对于前500个差异表达最多的基因，样本按疟原虫物种聚类，说明转录相似性主要体现在种内，尽管寄生率和各生活史阶段比例存在变异。第一主成分将两种姐妹种（P. azurophilum和P. leucocytica）与P. floridense分开；第二主成分将两种红细胞栖息种（P. azurophilum和P. floridense）与白细胞栖息的P. leucocytica分开。
"蜥蜴感染型疟原虫具有并表达血红蛋白消化基因的直系同源物"：在三种物种中检测到16个已知血红蛋白消化基因中10个的直系同源序列，涵盖血红蛋白消化途径的每个步骤。未检测到两个参与血红蛋白摄取的基因（泛素羧基末端水解酶1和KIC7）的直系同源物，以及四种消化酶（半胱氨酸蛋白酶falcipain 2a、半胱氨酸蛋白酶falcipain 2b、plasmepsin II和组织天冬氨酸蛋白酶/plasmepsin III）。目标RNA/DNA测序未能成功扩增这些基因。三种物种均具有falcipain 1的直系同源物，经系统发育分析确认；另一种plasmepsin转录本与plasmepsin VI直系同源物聚类，而非plasmepsin II或III，因此不太可能参与血红蛋白消化。在巴贝斯虫、泰勒虫和弓形虫中也鉴定到潜在直系同源序列，提示这些蛋白质可能具有其他功能。10个已鉴定基因中，8个在所有样本中表达值大于1 TPM。样本按物种聚类，P. floridense的Kelch13和血红素解毒蛋白表达水平最高，P. leucocytica的M1家族丙氨酸氨基肽酶表达最高，P. azurophilum所有转录本表达水平最低。
"血红蛋白消化基因的选择压力变化"：由于野外样本条件和样本量限制，研究人员采用选择压力分析作为蛋白质功能的替代指标。使用RELAX检测相对于参考分支的选择压力相对变化。结果表明，当P. azurophilum和P. leucocytica一起相对于其他疟原虫物种检测时，六个基因显示显著的选择松弛信号：Kelch13、Ap2复合体亚基μ、EPS15样蛋白、falcilysin、M1家族丙氨酸氨基肽酶和氨基肽酶P。血红素解毒蛋白和M17亮氨酸氨基肽酶无显著变化，二肽基氨基肽酶1和plasmepsin IV显示选择强化信号，这与预期不符。单独分析时，部分基因在两种姐妹种中显示不同的选择强度：EPS15样蛋白的选择松弛仅由P. leucocytica驱动；二肽基氨基肽酶1仅在P. azurophilum中有强化；plasmepsin IV仅在P. leucocytica中有强化。出乎意料地，P. floridense中多个基因也检测到显著选择松弛：Kelch13、Ap2复合体亚基μ、plasmepsin IV、falcilysin、M1家族丙氨酸氨基肽酶和氨基肽酶P，其模式与P. azurophilum而非其他血红蛋白消化寄生虫匹配。如假设，哺乳动物对照组无选择松弛信号，仅显示无变化或选择强化。
"未受松弛选择的基因可能在细胞中具有其他功能"：未显示相对选择变化的基因包括血红素解毒蛋白和M17亮氨酸氨基肽酶。研究人员推测消化酶可能作用于其他蛋白质，因此对寄生虫生存仍有必要。血红素解毒蛋白是唯一迄今仅涉及血红蛋白消化的基因。由于P. azurophilum和P. leucocytica不产生疟色素但转录HDP并维持其选择压力，研究人员推测该基因在疟色素形成之外具有其他功能。巴贝斯虫和泰勒虫中也存在直系同源物支持这一假说。计算蛋白质结构预测显示，三种蜥蜴疟原虫HDP的预测结构与P. falciparum高度一致，但P. falciparum中预测的组氨酸血红素结合位点His172在三种蜥蜴寄生虫中均未保守（突变为Asn）。近期结构和结合预测数据表明该组氨酸及His175对血红素结合并非必需，该序列数据支持这一新预测，因为若血红素结合位点应在所有产疟色素疟原虫中保守，则P. floridense缺乏His172但仍产生疟色素，表明His172对血红素结合非必需。基于蛋白质结构预测数据，研究人员预期三种蜥蜴疟原虫的HDP均具功能，并预测HDP在P. azurophilum和P. leucocytica中（可能也包括其他疟原虫）具有疟色素形成之外的其他功能。
讨论部分，研究人员首先阐述血红蛋白消化和疟色素形成是跨越疟原虫系统发育树的保守过程。10/16个基因存在于所有三种蜥蜴感染型疟原虫样本中，这是首次证据表明这些基因存在于蜥蜴感染型疟原虫基因组中并在整个系统发育树中保守。未鉴定的六个基因可能因转录组数据缺失而未被检出。P. floridense中血红蛋白摄取和疟色素形成相关基因表达较高，但样本包含混合生活史阶段可能影响表达水平。
选择压力变化可能反映了对蜥蜴宿主细胞环境的适应。P. azurophilum和P. leucocytica中参与血红蛋白摄取的基因受松弛选择，部分消化酶也显示松弛选择信号。P. floridense中同样检测到松弛选择，这出乎意料，因其确实进行血红蛋白消化和疟色素形成，提示三种蜥蜴疟原虫的这些基因均存在相对选择差异。三个基因（EPS15、二肽基氨基肽酶1、plasmepsin IV）在P. azurophilum和P. floridense（红细胞感染）与P. leucocytica（白细胞感染）中显示不同选择信号，暗示细胞环境而非血红蛋白消化缺失是选择压力的更强驱动因素。由于部分转录本未覆盖完整编码序列，未来需完整测序以更稳健地确认这些结论。
关于不消化血红蛋白是否存在选择性优势：P. leucocytica栖息于无血红蛋白的白细胞，不产疟色素属预期；P. azurophilum虽有血红蛋白接触和消化能力，但无疟色素产生，表明其或不消化血红蛋白，或无疟色素形成情况下消化血红蛋白，需有替代方法处理有毒血红素累积。研究人员推测减少疟色素产生可能有利于混合感染的建立和持续，该性状进化后可能使祖先寄生虫能在白细胞中持续存在并分化出现存P. azurophilum和P. leucocytica。
最后，研究人员强调非哺乳动物比较数据对人类疟疾研究的价值。哺乳动物疟原虫可能起源于鸟类或蜥蜴，祖先血红蛋白消化途径可能更接近这些爬行动物寄生虫而非哺乳动物寄生虫。选择测试表明七种基因在哺乳动物疟原虫中相对于其他分支显示选择强化/增加信号。该途径在抗疟药物激活和抗性中的作用意味着比较选择分析有助于识别未来药物靶点：在疟原虫中保守、在哺乳动物寄生虫中必需、且无选择压力变化的蛋白质可能是潜在药物靶点；受松弛选择的基因可能非寄生虫所必需，不宜作为药物靶点；受选择强化的基因可能正在进化，未来可能导致药物抗性。
研究结论：该研究首次证明蜥蜴感染型疟原虫具有并表达脊椎动物疟原虫保守的血红蛋白消化途径基因。尽管这些基因存在，三种蜥蜴寄生虫均显示选择压力变化模式，表明宿主细胞环境可能对这些基因施加不同的进化约束。不产生疟色素的寄生虫仍维持血红素解毒蛋白基因，暗示该蛋白质可能在疟色素形成之外具有保守的细胞功能。这些发现强调了研究非哺乳动物疟原虫对于理解疟原虫生物学进化以及指导抗疟药物开发策略的重要价值。
