《Environmental DNA》：Environmental DNA Biosurveillance of Chelonid Herpesvirus 5 (ChHV5) in Endangered Sea Turtles Around Singapore
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摘要：海龟纤维乳头瘤病（fibropapillomatosis, FP）是一种潜在致残且与肿瘤相关的疾病，其与病原体龟类疱疹病毒5型（chelonid herpesvirus 5, ChHV5）密切相关。FP存在于所有濒危海龟物种中，遍布大部分海洋盆地，且在许
摘要：海龟纤维乳头瘤病（fibropapillomatosis, FP）是一种潜在致残且与肿瘤相关的疾病，其与病原体龟类疱疹病毒5型（chelonid herpesvirus 5, ChHV5）密切相关。FP存在于所有濒危海龟物种中，遍布大部分海洋盆地，且在许多地理区域发病率迅速上升。尽管FP是一种新兴疾病威胁，但东南亚地区海龟种群中FP和ChHV5的流行情况仍相对未被充分研究，这凸显了开展有效疾病监测与监控策略的必要性。为填补这一空白，本研究报道了首个来自东南亚的近全长度ChHV5基因组，该基因组来源于2022年在新加坡水域搁浅的一只患FP海龟。该病毒基因组连同宿主线粒体基因组，为ChHV5分布及该区域宿主种群来源提供了关键参考点。为进一步加强监测工作，研究人员还探索了应用环境DNA（environmental DNA, eDNA）方法作为非侵入性生物监测工具，用于检测海水和沉积物中的ChHV5 DNA。通过实时PCR，研究人员成功在饲养患病海龟的康复池水中检测到ChHV5 DNA，且病毒丰度在海龟重新放入池中后有所增加。这一观察结果与直接病毒脱落作为潜在ChHV5传播途径的假设一致。最后，研究人员通过加标回收实验评估了使用实时PCR从沉积物样本中检测ChHV5 DNA的可行性。该方法随后被应用于从新加坡周边玳瑁海龟巢穴采集的沉积物样本，未观察到阳性检测结果。总体而言，本文所述的环境DNA方法和下一代测序方法为ChHV5生物监测奠定了基础，为未来东南亚海龟监测工作提供了重要参考数据。
**论文解读文章：新加坡周边濒危海龟中龟类疱疹病毒5型的环境DNA生物监测**
**研究背景、存在问题与研究动机**
海龟纤维乳头瘤病是一种与龟类疱疹病毒5型（ChHV5）密切相关的肿瘤性疾病，影响全球所有七种海龟，其中绿海龟（*Chelonia mydas*）最易感。FP可导致海龟皮肤、眼睛及内脏出现肿瘤，阻碍游泳、躲避天敌和摄食等自然行为，最终可能导致死亡。尽管FP作为一种新兴疾病威胁日益受到关注，但东南亚地区关于FP和ChHV5流行情况的研究仍然匮乏，新加坡尚无相关数据。然而，邻近地区（如台湾和马来西亚婆罗洲）的病例报告表明病毒已接近新加坡沿海水域，凸显了开展当地疾病监测的紧迫性。传统生物采样可能对筑巢海龟和刚孵化的幼龟造成额外压力，因此，非侵入性的环境DNA（eDNA）方法为监测和检测海龟种群中的ChHV5提供了有前景的替代方案。本研究旨在通过主动和被动生物监测方法，利用eDNA方法和基因组测序，评估ChHV5和FP对新加坡濒危海龟的威胁，并建立区域参考数据。论文发表在《Environmental DNA》。
**主要关键技术与方法**
研究人员采用实时PCR对组织、拭子和eDNA样本进行初步筛查，使用靶向ChHV5 DNA聚合酶（UL30）基因保守片段的引物和探针。对肿瘤组织样本进行高通量测序：使用Illumina平台对2020和2021年绿海龟尸体样本进行乌枪法测序，使用Nanopore平台对2022年活体绿海龟肿瘤组织和水样进行长读长测序，并通过自适应采样富集ChHV5基因组。通过MAFFT进行序列比对，使用RaxML-ng基于GTR+I+G模型构建系统发育树。针对沉积物eDNA，开展加标回收实验验证检测可行性。样本来源包括新加坡东海岸公园发现的绿海龟尸体、拉撒路岛附近救获的活体绿海龟及其康复池水，以及2022和2023年筑巢季节从新加坡主岛和离岛采集的12个玳瑁海龟巢穴的沉积物、海水、幼龟拭子和组织样本。
**研究结果**
**3.1 从康复池海水和绿海龟组织样本中回收ChHV5**
通过实时PCR，研究人员发现ChHV5可在康复池水eDNA中轻松检测到。即使从3000升池水中取2升样本，ChHV5仍可检测到，且病毒载量随海龟存在与否而变化。海龟取出池子30分钟后，病毒仍可检测到（Ct值31.29–31.49），表明ChHV5可在水系统中持续存在。海龟重新放入池子5分钟后，Ct值降至27.96，表明病毒脱落对海龟重新引入快速响应。多种肿瘤和器官样本呈阳性，其中鳍状肢和颈部肿瘤组织Ct值最低（19.52和17.67）。拭子样本Ct值范围为25.44–37.07，显示病毒可直接脱落至周围环境。长读长非靶向乌枪测序从6升池水中回收了4个绿海龟线粒体片段，以及6个跨越约15.5 kbp区域（包含部分UL30基因）的Nanopore读长。
**3.2 ChHV5系统发育关系与绿海龟种群来源**
从2022年活体绿海龟肿瘤组织组装获得132,563 bp的近全长度ChHV5基因组，与参考基因组（HQ878327.2）的相似度为99.48%。由于尸体腐烂，2020和2021年样本仅分别恢复20.5%和8.43%的病毒基因组，但三个病例均恢复了完整的16 kbp绿海龟线粒体基因组。基于约43 kbp部分区域的系统发育分析显示，新加坡ChHV5毒株与夏威夷和墨西哥湾的序列呈并系关系，但分辨率有限，因为现有大多数基因组来自美国和夏威夷。绿海龟线粒体控制区序列分析表明，新加坡病例的单倍型与文莱湾及东马来西亚（如沙捞越、阿鲁岛和贝劳群岛）的觅食地和繁殖地单倍型（C4、C5、C8、C14、CmP49、CmP87、CmP89）密切相关。
**3.3 从沙子中检测ChHV5的可行性及巢穴主动监测**
加标回收实验表明，使用实时PCR可从加标绿海龟肿瘤悬液的清洁沙子中检测到ChHV5 DNA（Ct值32.57和33.20），而未加标样本和阴性对照无Ct值，验证了该检测方法的可行性。在两年的玳瑁海龟巢穴采样中，共收集99个沙子eDNA样本、129个未孵化蛋和死亡幼龟、11个海水eDNA样本和62个活幼龟拭子，所有样本经实时PCR检测均为ChHV5阴性。阴性结果可能受检测限、样本量、保存方法和检测灵敏度等因素影响，但综合结果提供了当地玳瑁海龟目前无该疾病的基线证据。
**讨论与结论**
本研究首次在新加坡基于三年间从两只绿海龟尸体和一只活体绿海龟采集的肿瘤组织分子检测到ChHV5，强化了FP与ChHV5在东南亚区域的关联。通过Nanopore测序获得东南亚首个近全长度ChHV5基因组，为区域样本不足的病毒数据集提供了关键参考。系统发育分析显示现有地理采样有限，突出了增加东南亚区域采样的必要性。绿海龟线粒体基因组分析表明本地单倍型与东马来西亚的觅食和繁殖种群相关，为追溯病毒暴露途径提供了背景。eDNA方法在康复池水中的成功应用展示了非侵入性监测的潜力，但开放海洋环境面临洋流稀释、信号随机性等挑战。沉积物eDNA检测在巢穴样本中未发现ChHV5，为新加坡玳瑁海龟筑巢地目前无病毒提供了基线证据。
翻译研究结论部分：本研究报告了首个来自东南亚的近全长度ChHV5基因组，为未来系统发育和进化研究提供了重要参考点，并凸显了增加区域采样的必要性。研究人员证明了病毒向康复池水中的脱落可以通过eDNA采样进行非侵入性追踪，展示了该方法在更广泛病原体监测中的潜力。最后，在新加坡周边玳瑁海龟巢穴沉积物中未检测到ChHV5 DNA，为这些地点目前无ChHV5存在提供了基线证据。这强调了在持续监测工作中早期检测对于及时干预海龟种群的重要性。总体而言，这些方法论和方法为新加坡基于eDNA的ChHV5监测建立了基线，并代表了迈向区域海龟及其相关病原体生物监测框架的重要第一步。
