蛱蝶（Nymphalidae）退化前胸足（第一胸节足，T1legs）的差异基因表达分析

《Insect Molecular Biology》：Distinctive gene expression in the reduced first thoracic legs of a nymphalid butterfly

　　

摘要：蛱蝶（Nymphalidae）在鳞翅目（Lepidoptera）中具有独特的足形态：它们是唯一一个雌雄成虫均具高度退化前胸足（T1，即第一胸节足）的类群，该足不用于行走。既往研究表明T1足可能具化学感受（chemosensory）功能。为探究支撑此生物学特征的基因基础，研究人员对雌性草甸褐蝶（Maniola jurtina）进行了差异基因表达（Differential Gene Expression, DGE）分析。研究发现，蛱蝶T1足具有区别于T2（中胸）和T3（后胸）步行足及感觉触须（sensory palps，此处指下唇须 labial palps）的转录组谱（transcriptomic profile）。研究人员发现超过250个基因共同表达于蛱蝶T1足与触须中，但不表达于T2足。尽管存在重叠，T1足的基因表达谱与步行足（T2、T3）的相似度仍高于与触须的相似度。T1足与触须共有表达的基因包括一个源于蛱蝶特异性基因复制（nymphalid-specific duplication）的编码胰蛋白酶结构域蛋白（trypsin-domain protein）的基因，以及其他若干参与感觉功能的基因，含具推定化学感受（putative chemosensory）作用的基因。此外，一个蓝敏感视蛋白基因（blue-sensitive opsin gene）特异地表达于T1足。研究结果表明，M. jurtina 中T1足与步行足间存在明确的转录组差异，指向这些差异的功能基础，包括轻微获得了类触须样的基因表达特征。

蛱蝶退化前胸足（T₁legs）特异转录组及感觉功能偏向性的转录组学解析——发表于《Insect Molecular Biology》

研究背景与立项依据：

大多数鳞翅目成虫使用全部六足行走，但蛱蝶科（Nymphalidae）与蚬蝶科（Riodinidae）具高度退化的前胸足（T₁legs/prothoracic legs），仅依靠中胸（T₂）和后胸（T₃）足行走。蛱蝶两性均表现此特征。T₁足被认为在演化中丧失了行走功能并获得新型感觉（尤其是化学感受，用于寄主植物识别及产卵定位）功能，但其分子基础不明。节肢动物足与口器触须（labial palps）被认为是串行同源（serial homology）结构，源自共同祖先附肢。本研究以欧洲常见蛱蝶亚科（Satyrinae）物种草甸褐蝶 Maniola jurtina 为对象，通过比较T₁足、T₂/T₃步行足及下唇触须（labial palps）的转录组，探究：(i) T₁足与步行足的转录差异；(ii) T₁足是否获得触须样基因表达；(iii) 蛱蝶特有新基因（novel genes/taxonomically restricted genes）是否参与T₁足特化。

主要关键技术方法：

研究人员于英国Wytham Woods采集雌性 M. jurtina 成虫，液氮冷冻后于干冰上解剖分离下唇触须（palps）、T₁、T₂、T₃足，各组织来自多个个体混合为3个生物学重复（biological replicates）。提取总RNA后进行Illumina NovaSeq X Plus PE150 转录组测序（~20M paired-end reads/sample）。测序读段比对至 M. jurtina 参考基因组（ilManJurt1.1, GCA_905333055.1），用StringTie进行基因表达定量（FPKM），采用DESeq2进行差异基因表达分析（筛选标准：base mean >5，log₂FC >1，adj. p <0.05），校正批次效应。感觉相关基因通过Pfam结构域扫描（chemosensory proteins: 7tm_4/OR, 7tm_7/GR, Lig_chan/IR, PBP_GOBP/OBP, OS-D/CSP, CD36/SNMP）及BLASTp比对已知光传导蛋白种子序列注释。新基因分析基于50种鳞翅目及毛翅目蛋白组，用OrthoFinder构建直系同源群（orthogroups），IQ-TREE建物种树，定位蛱蝶支系特有基因家族增益。数据可视化采用PCA、热图、火山图及Venn图，感觉基因组织表达差异用z-score标准化展示。

研究结果：

Transcriptomic differences between T₁legs and walking legs（T₁足与步行足的转录组差异）

主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）显示触须转录组与其他组织差异最大，T₂与T₃足紧密聚类，T₁足单独成簇但与步行足较近、远于触须。T₂与T₃足间仅1个基因差异表达，证实步行足转录组高度相似。T₁vs T₂足比较鉴定出791个差异表达基因（402个T₁高表达，389个低表达），表明退化T₁足具独特转录谱。

Larger differences in expression profile observed between legs and palps（足与触须间存在更大表达谱差异）

T₁vs 触须检出1718个差异表达基因，T₂vs 触须检出2864个，证明触须转录组与任何足均差异显著，且T₁足与步行足的相似性仍高于与触须的相似性。T₁独有差异基因（相对于触须和T₂足共有106个）中含推定机械感受离子通道同源基因 nanchung（ENSMJUG00000008717）、5-羟色胺受体基因、蓝敏感视蛋白（blue-sensitive opsin, BRh; ENSMJJUG00000015046）及数个性状决定同源框基因（vnd, unpg/Gbx, forkhead），提示T₁足获得了不同于步行足及触须的感觉相关功能。

Nymphalid reduced legs have acquired aspects of palp-like gene expression（蛱蝶退化足获得了部分触须样基因表达）

分析显示277个基因在T₁足与触须中均相对T₂足上调（palp- and T₁-upregulated genes），286个基因两者均下调。说明T₁足部分共opted了触须的典型生化/调控表达特征。其中含1个推定化学感受蛋白（Chemosensory Protein, CSP）基因及POU class homeobox基因。对感觉基因家族（OR, GR, IR, OBP, CSP, SNMP及光传导基因）z-score分析发现：25个化学感受相关基因仅在T₁足呈正z-score（多数属OBP与OR），17个在触须和T₁足共表达；蓝敏感视蛋白（Blue Rhodopsin, BRh）仅在T₁足特异表达（平均FPKM T₁=6.7，其他组织<0.4），暗示T₁足具非眼感光或特殊感觉潜能。

A nymphalid-specific gene duplication upregulated in palps and T₁legs（蛱蝶特异性基因复制产物在触须和T₁足中共上调）

277个T₁/触须共上调基因归属235个直系同源群（orthogroups），其中1个直系同源群（OG0000217）在蛱蝶中发生明显串联复制（蛱蝶内1–11拷贝，均值6拷贝；非蛱蝶鳞翅目多为单拷贝），编码含Trypsin结构域（Pfam PF00089）的丝氨酸蛋白酶类蛋白。M. jurtina 该直系同源群中仅1个拷贝（ENSMJUG00000013800）在T₁足与触须共上调，其余拷贝表达模式分化或组织特异，提示基因复制后亚功能化（subfunctionalisation），该trypsin-domain protein可能在蛱蝶T₁足与触须的嗅觉/化学感受外周调控（perireception）中起作用。

Novel genes do not underpin transcriptomic differences in T₁legs（新基因并非T₁足转录组差异的主要驱动因素）

基于50种鳞翅目+毛翅目外群分析，鉴定到蛱蝶支系特有起源57个直系同源群（novel orthogroups/taxonomically restricted genes），其中19个源于祖先基因复制后剧烈分化，3个疑似水平基因转移（Horizontal Gene Transfer, HGT），35个为孤儿基因（orphan/de novo genes）。但这57个新基因均未在T₁足或触须中显著差异表达，仅7个在任何被检组织中微弱表达。表明蛱蝶T₁足的转录组特化主要由已有基因的差异化调控及基因家族扩张（如trypsin-domain gene duplication）驱动，而非新基因的出现。

讨论与结论总结（翻译浓缩）：

节肢动物附肢具串行同源关系，但可随演化发生结构与功能分歧。本研究证实蛱蝶T₁足转录组仍最接近步行足（T₂/T₃），但明显分歧并部分获得触须（labial palps）样基因表达特征，同时T₁足还上调特异的感觉相关基因（含blue-sensitive opsin及化学感受基因），支持其从行走附肢向感觉附肢的功能转变。蛱蝶特异性trypsin-domain gene duplication的一个拷贝在T₁足与触须共表达，可能参与化学感受的外周调节。蛱蝶支系新起源基因未参与T₁足特化的主要转录重编程。综上，蛱蝶退化前胸足（T₁legs）保留了与步行足的基础转录相似性，但通过已有感觉/信号基因的差异调控及少数基因家族（如trypsin-domain genes）的蛱蝶特异性扩增与亚功能化，获得了区别于步行足并部分趋同于触须的感觉偏向性转录组，为其退化和新感觉功能提供分子基础。