《Insect Molecular Biology》：Transcriptional responses of Aedes aegypti chemosensory tissues in response to volatile DEET and citronella oil
编辑推荐：
避蚊胺(DEET)与香茅油(Citronella oil)是最广泛使用的两种蚊虫驱避剂，然而二者对化学感受组织的影响尚未完全阐明。在其蒸气相中，驱避效应涉及嗅觉系统，蚊虫通过其触角(maxillary palps和proboscis)检测并响应多种气味分子。本
避蚊胺(DEET)与香茅油(Citronella oil)是最广泛使用的两种蚊虫驱避剂，然而二者对化学感受组织的影响尚未完全阐明。在其蒸气相中，驱避效应涉及嗅觉系统，蚊虫通过其触角(maxillary palps和proboscis)检测并响应多种气味分子。本研究研究人员首先进行行为驱避实验，表明DEET与香茅油均能有效削弱埃及伊蚊(Aedes aegypti)雌蚊的宿主定位能力（即降落于宿主及吸血）。随后研究人员利用RNA测序(RNA-seq)评估了埃及伊蚊触角、口器及去头躯体在暴露于挥发性驱避剂后全局基因表达的变化。结果显示，转录变化在蚊口器中较其他组织显著更大。两种驱避剂对嗅觉相关基因最显著的响应是组成蚊虫CO2受体的三个亚基(Gr1、Gr2和Gr3)的表达受抑。与线粒体功能和代谢相关的基因亦被抑制。DEET暴露进一步特征性地表现为细胞色素P450(cytochrome P450)——昆虫主要解毒酶——mRNA表达的显著抑制。综上，本研究为阐明埃及伊蚊化学感受组织对DEET与香茅油暴露的嗅觉及生理响应提供了新的见解。
《Insect Molecular Biology》刊载论文解读：埃及伊蚊化学感受组织对挥发性DEET与香茅油暴露的转录响应研究
一、研究背景与立题依据
埃及伊蚊（Aedes aegypti）是登革热、寨卡、黄热病和基孔肯雅热等重要虫媒病毒的主要传播媒介，具高度嗜人性与内栖性。蚊虫依靠其高度发达的嗅觉系统——主要包括触角（antennae）、下颚须（maxillary palps）及喙唇（labella of proboscis，统称口器 mouthparts）——感知宿主释放的挥发性有机物（如CO?、乳酸等）以完成宿主搜寻与血餐摄取。避蚊胺（N,N-diethyl-3-methylbenzamide，DEET）是应用逾65年的"金标准"驱避剂，植物源香茅油（citronella oil，源自Cymbopogon属，主要成分为柠檬醛 citronellal、香茅醇 citronellol 及香叶醇 geraniol）亦被广泛使用。然而，挥发性DEET与香茅油作用于蚊虫化学感受组织的精确分子机制——包括对嗅觉信号通路、解毒酶系及基础生理过程的影响——仍不明确。现有DEET作用假说包括"混淆（confusant）"、"嗅辨回避（smell and avoid）"及"掩蔽（masking）"，香茅油则可能通过激活TRPA1或经气味结合蛋白（odorant-binding protein，OBP）介导产生驱避，但缺乏化学感受组织水平的转录组学证据。长期单一使用驱避剂可能导致蚊虫产生不敏感性，因此鉴定特异性分子靶标（如味觉受体 gustatory receptor，GR；OBP；气味受体 odorant receptor，OR）对新型驱避剂研发具有重要意义。为此，研究人员通过行为学验证驱避效力后，采用RNA测序解析埃及伊蚊触角、口器（下颚须+喙）及去头躯体（headless bodies）经挥发性DEET或香茅油暴露后的差异基因表达谱，以揭示其分子作用特征。
二、主要关键技术方法
研究人员使用来自BEI Resources的埃及伊蚊（COSTA RICA品系，MRA-726）标准实验室种群，于27℃、80% RH、12 h光暗周期下饲养，取羽化后约3天未吸血雌蚊并饥饿24 h。行为学实验采用人工膜血餐系统（胶原膜覆盖肝素抗凝羊血），比较50% DEET、50%香茅油与50%乙醇对照对雌蚊降落与吸血数的影响（各处理n=75，非选择实验，重复5次），统计采用Kruskal-Wallis H检验与Dunn's事后检验。转录组实验将雌蚊置于密闭自定义容器中，仅经蒸气相（无接触）暴露于滤纸吸附的50% DEET、50%香茅油或50%乙醇对照15 min，再静置20 min后液氮速冻；分别解剖收集成对触角（75对/样本）、下颚须+喙（50套/样本）及去头躯体（25个/样本），提取总RNA构建链特异性mRNA文库（低起始量建库用于触角与口器），于Illumina NovaSeq 6000平台进行100 bp双端测序。原始读段经质控、去接头及去poly(A)尾后比对至Ae. aegyptiAaegL5参考基因组（19,804个基因），使用DESeq2进行差异表达分析（阈值：p<0.05，|log?FC|≥0.58即FC≥1.5，平均表达量>100且具组织特异性高表达过滤）。嗅觉基因列表从Ensembl Metazoa AaegL5数据库获取（42个OBP、30个GR、72个OR、1个IR），功能注释与KEGG通路富集采用DAVID 2021。部分差异基因经qPCR（引物效率1.00±0.20，2?ΔΔCt法，以ACT为内参）验证。
三、研究结果
（一）Volatile DEET and citronella oil effectively repelled Ae. Aegyptimosquitoes（挥发性DEET与香茅油有效驱避埃及伊蚊雌蚊）
行为学测定显示对照组77%雌蚊降落膜喂器、69%吸血；DEET组仅6.7%降落、0%吸血，香茅油组11%降落、2.7%吸血。Kruskal-Wallis检验表明处理组降落数与吸血数均显著低于对照组（p=0.006与p=0.003），DEET与香茅油间无显著差异。证实50% DEET与50%香茅油蒸气相均对埃及伊蚊雌蚊宿主搜寻（降落及血餐）具显著驱避效果。
（二）Global gene expression profiles are influenced by repellent exposure（驱避剂暴露影响全局基因表达谱）
共测序33个cDNA文库（DEET触角因异常表达剔除1个重复），每样本>80%读段唯一比对至AaegL5。主成分分析（principal component analysis，PCA）显示各组织样本按处理松散聚类，表明驱避剂暴露一定程度改变各组织全局表达；对照组样本变异大于处理组，提示驱避剂诱导了更均一的特异性（回避）响应。
（三）Gene expression differences predominate in the maxillary palps and proboscis（基因表达差异主要集中于下颚须与喙）
各组织差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）占比<7%。口器检出DEET处理894个DEG、香茅油432个DEG；触角仅DEET 8个、香茅油36个DEG；去头躯体共353个DEG（DEET占301个）。DEET致大多数基因下调——口器97%、触角75%、躯体60%；香茅油口器亦74%下调，但触角81%上调、躯体73%上调。口器中香茅油下调基因79%与DEET共下调方向一致。qPCR验证了DEET口器中Gr2（2.15倍下调）、Gr3（1.92倍下调）、Obp10（2.3倍下调）及Obp23（3.06倍下调），与RNA-seq一致（p<0.001）。
（四）Volatile repellent exposure causes expression changes related to mitochondrial dysfunction, impaired metabolism and P450 inhibition（挥发性驱避剂引起与线粒体功能障碍、代谢抑制及P450抑制相关的表达变化）
KEGG与DAVID注释显示，DEET与香茅油均显著下调口器中与线粒体功能相关的基因簇——氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）、三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）、电子传递、ATP合成、硫辛酸代谢、糖酵解及线粒体转运/导入；同时抑制细胞骨架（马达蛋白、肌动蛋白actin）与翻译相关基因，以及氨基酸代谢、碳代谢、丙酮酸代谢等代谢通路。DEET处理去头躯体亦有类似但程度较弱的下调。DEET独特地引起口器细胞色素P450（cytochrome P450，主要昆虫Ⅰ相解毒酶）基因簇及部分应激响应基因（先天免疫、蛋白折叠）显著抑制；香茅油口器中仅少量P450被抑制（19个）。其他解毒相关基因家族（表皮蛋白、UDP-糖基转移酶、谷胱甘肽-S-转移酶glutathione S-transferase，GST、羧基/胆碱酯酶）未见显著富集。触角无显著富集通路或簇。
（五）Olfaction is modulated by repellent exposure（嗅觉通路受驱避剂暴露调控）
放宽阈值（p<0.05，无FC限制）筛查嗅觉基因：触角含较多显著嗅觉DEG（香茅油21个含6 OBP/9 OR/5 GR/ORCO；DEET 9个含7 OR/2 GR），但倍数变化均<1.3倍（多数<1.5倍）。口器中DEET检出11个嗅觉DEG（6 OBP+5 GR）、香茅油7个（2 OBP+1 OR+4 GR）。最显著的是构成埃及伊蚊CO?受体三个亚基——Gr1(AAEL002380)、Gr2(AAEL002167)、Gr3(AAEL010058)及Obp10(AAEL007603)、Obp23(AAEL006109)——在两种驱避剂下均显著下调（通常log?FC<-1即FC>2，p<0.005）。去头躯体仅检出4个驱避剂特异嗅觉DEG（3 OBP+1 GR）。
（六）Validation of differential expression by qPCR（qPCR验证差异表达）
所选4个口器基因（Gr2、Gr3、Obp10、Obp23）经qPCR确认DEET处理后均显著下调，变化倍数与测序结果趋势一致，统计学显著（p<0.001），证实转录组数据的可靠性。
四、讨论与结论总结（翻译浓缩研究结论部分）
蚊虫通过复杂嗅觉系统检测挥发性及空间驱避剂，但多数驱避剂的精确作用机制尚不完全清楚。本研究表明DEET与香茅油蒸气相均可有效阻止埃及伊蚊雌蚊降落与吸血，且二者引发的转录响应在口器（下颚须与喙唇）中最强烈——这与触角为初级嗅觉器官的传统认知不同，反映出口器在宿主近距离检测及驱避化合物识别中的重要作用（下颚须含专司CO?检测的cpA感觉神经元，定位于毛形感器sensilla）。
最重要的发现是两种驱避剂均显著下调口器中编码CO?受体亚基的Gr1、Gr2、Gr3（构成蚊子CO?受体核心，Gr1与Gr3形成受体，Gr2调节敏感性，表达于下颚须cpA神经元）及可能的辅助OBP（Obp10、Obp23）。CO?是蚊虫最主要宿主搜寻激活物，并可增强其对皮肤气味、热及视觉线索的敏感性；该受体亚基下调若导致CO?感知功能受损，将广泛抑制蚊虫宿主搜寻行为。DEET还特征性地引起口器细胞色素P450（昆虫主要解毒酶）mRNA显著抑制，与先前毒理学报道一致，可能致未代谢化合物累积。两驱避剂均下调口器线粒体功能与多代谢通路基因，提示潜在能量代谢干扰，但其对适合度的影响需进一步研究。触角多数嗅觉DEG变化幅度微小（FC<1.3），OR共受体（OR co-receptor，Orco/ORCO）仅在香茅油触角微诱导且在对照口器本底表达已较高。研究未能确定所测基因表达变化是否为驱避行为的直接分子靶标（因驱避为快速生理反应而转录测定在暴露后35 min），但提供了化学感受组织对驱避蒸气响应的全景转录图谱。
综上，DEET与香茅油暴露诱导埃及伊蚊化学感受组织显著分子变化：共同抑制口器CO?感受GR亚基及关联OBP可能影响宿主搜寻；二者还抑制细胞基础生理过程（线粒体功能、代谢），DEET额外抑制P450解毒酶表达。虽与驱避直接作用机制的因果关联待敲低/敲除功能验证及更短时点采样阐明，本研究为理解化学感受组织在驱避剂及外源物(xenobiotic)响应中的角色提供框架，并指出Gr1/2/3、Obp10/23及P450可作为潜在驱避剂作用靶标供后续研究。
