分离自臭鱼卤（kusaya gravy）的链霉菌（Streptomyces）TUA-HK1GM菌株中盐诱导的7-deoxypactamycin与寡霉素（oligomycin）产生

《The Journal of Antibiotics》：Salt-induced 7-deoxypactamycin and oligomycin production in Streptomyces sp. strain TUA-HK1GM isolated from kusaya gravy

　　

链霉菌（Streptomyces）作为革兰氏阳性细菌，可产生多种抗生素及生物活性化合物作为次级代谢产物。虽然该类菌通常分离自土壤环境，但亦发现于海洋生境等非土壤环境中，此类非陆生菌株可能具有区别于土生链霉菌的特定代谢特征。本研究针对研究人员此前自高盐含量的传统日本发酵鱼卤kusaya gravy中分离的链霉菌（Streptomyces）sp. strain TUA-HK1GM，考察其表型与分类学特征及抗生素产生能力。微生物学分析显示该菌株与近缘种存在明显差异，尤其表现为可在7% NaCl条件下生长；系统发育分析提示其为新颖的放线菌物种。研究人员探讨了NaCl添加对次级代谢产物生物合成的影响，重点关注抗生素产生：无NaCl时该菌株产生抗真菌化合物，鉴定为寡霉素（oligomycin）A与B；而在NaCl存在时，除寡霉素外还大量产生抗葡萄球菌（Staphylococcus）化合物，其m/z值为543.2813 [M+H]+与565.2633 [M+Na]+，与7-deoxypactamycin一致；寡霉素A的产量亦表现出依赖于NaCl暴露时长的增强（32倍）。培养过程中补充NaCl表明，延长NaCl暴露可提高抗生素产量。上述结果说明新颖菌株TUA-HK1GM具有通过NaCl激活次级代谢的特征机制。

研究背景：链霉菌（Streptomyces）是重要次级代谢产物（secondary metabolite）来源，大多分离自土壤，但土壤来源新颖链霉菌及新抗生素的发现率下降，因此非土壤环境如海洋成为新颖放线菌（Actinomycetes）及活性代谢物的重要来源。kusaya是日本伊豆诸岛传统发酵鱼制品，其制作使用的kusaya gravy是一种长期复用、高盐且富含鱼类与海水有机物的发酵卤水，形成独特微生物生态系，并赋予kusaya较强耐藏性，推测与卤水中微生物产生的抗菌物质有关。研究人员此前已从kusaya gravy中分离到多株产抗生素链霉菌，其中Streptomyces sp. strain TUA-HK1GM对抗真菌活性突出，但其分类特征及产物谱尚不清楚，且该菌株来自高盐特异生境，可能具盐依赖的代谢特征。本研究旨在明确TUA-HK1GM的表型与分类地位，鉴定其产抗菌/抗真菌化合物，并分析NaCl对其生长及次级代谢产物（secondary metabolite）生物合成的调控效应，论文发表于《The Journal of Antibiotics》。

主要关键技术方法：样本为自八丈岛kusaya gravy分离的Streptomyces sp. strain TUA-HK1GM；采用ISP2及含3% NaCl的ISP2（ISP2-3N）液体/固体培养基进行培养；表型鉴定按标准链霉菌鉴定规程在ISP2–7培养基上观察形态、生理生化（明胶液化、淀粉水解、硝酸盐还原、牛奶蛋白胨化、碳源利用、NaCl耐受性等）；基因组用PacBio Sequel II测序，注释用DFAST，系统发育与物种界定用TYGS、OrthoANI（orthologous average nucleotide identity）、dDDH（digital DNA–DNA hybridisation）；次级代谢产物生物合成基因簇（BGC，biosynthetic gene cluster）预测用antiSMASH v7.0.1；抗菌/抗真菌化合物纯化采用溶剂萃取（乙酸乙酯等）、硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶过滤、TLC（thin-layer chromatography）及TLC-bioautography；结构解析用ESI-MS（electrospray ionisation-mass spectrometry）、LC-QToF-MS（liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry）、¹H NMR（nuclear magnetic resonance）、¹³C NMR，对照标准品为寡霉素混合物及自Streptomyces pactum ATCC 27456^T制备的7-deoxypactamycin；NaCl效应实验设ISP2（无NaCl）、ISP2-3N（全程3% NaCl）及在培养第4天或第7天补加NaCl至终浓度3%以控制暴露时长，测定干菌体重量（DCW，dry cell weight）并用LC-QToF-MS定量代谢物。

研究结果：

Phenotypic characteristics and phylogenetic position of strain TUA-HK1GM：研究人员通过形态、生理生化及ISP培养基培养特征分析发现，TUA-HK1GM与近缘种Streptomyces griseoruber DSM 40281^T有明显差异，尤能于7% NaCl下生长。全基因组测序获得11,101,742 bp、G+C含量71.8%，注释得到9,875个蛋白编码序列等；antiSMASH预测出35个次级代谢产物BGC。TYGS分析最近缘为S. griseoruber DSM 40281^T，但dDDH为54.3%、OrthoANI为92%，均低于物种阈值（dDDH 70%、ANI 95–96%），结论为该菌株代表新颖链霉菌物种。

Structural elucidation of antifungal compounds：无NaCl（ISP2培养基）培养上清提取物的抗真菌活性组分经纯化与ESI-MS、NMR分析，分子离子峰m/z 813.5128 [M+Na]⁺（C₄₅H₇₄O₁₁）和827.4912 [M+Na]⁺（C₄₅H₇₂O₁₂）分别对应寡霉素（oligomycin）A与B，¹H/¹³C NMR信号与文献吻合，结论为该株无盐条件下主要产寡霉素A、B作为抗真菌（抗Aspergillus brasiliensis）物质。

Strain TUA-HK1GM produces 7-deoxypactamycin in the presence of NaCl：在ISP2-3N（含3% NaCl）培养提取物中抗Staphylococcus epidermidis活性显著增强，纯化后ESI-MS给出m/z 543.2813 [M+H]⁺、565.2633 [M+Na]⁺，分子式C₂₈H₃₈N₄O₇与7-deoxypactamycin一致；LC-QToF-MS保留时间与标准品相同，ESI-MS/MS碎片图谱一致，结论为NaCl存在时该菌株产生7-deoxypactamycin。

Genetic characterisation of olm and ptm BGCs：基因组antiSMASH分析确认存在寡霉素BGC（olm）与7-deoxypactamycinBGC（ptm）；olm BGC含典型I型PKS（polyketide synthase）基因olm1–olm7、细胞色素P450基因olmB、LuxR家族转录调节基因olmI/olmII，与Streptomyces avermectinius ATCC 31267^T的olm BGC高度共线；ptm BGC含pkS基因（ptmI、ptmK、ptmO、ptmQ、ptmS）、radical SAM基因（ptmC、ptmL、ptmM等）、糖基转移酶ptmJ及修饰酶，但缺失ptmX、ptmW、ptmP，且C-7羟化相关的细胞色素P450 ptmY被转运蛋白基因替换，结论为该株具备olm与ptm BGC但ptm BGC有结构变异，与只产7-deoxypactamycin（无C-7羟基）表型吻合。

NaCl-induced 7-deoxypactamycin and oligomycin production：DCW测定显示ISP2-3N中生物量约两倍于ISP2；单位生物量提取物的抗S. epidermidis活性ISP2-3N显著高于ISP2，LC-QToF-MS证实ISP2中几乎无7-deoxypactamycin峰，ISP2-3N中大量出现。分段补NaCl实验表明：NaCl暴露期越长，抗S. epidermidis与抗A. brasiliensis抑菌圈越大；7-deoxypactamycin相对产量在暴露4天、7天、10天时分别为无NaCl（ISP2）的2.2倍、8.5倍、11倍；寡霉素A在无NaCl时极少，暴露4、7、10天时分别为无NaCl的1.5、10、32倍；寡霉素B在无NaCl时已产生，但随NaCl暴露延长仍上升。结论为NaCl不仅诱导7-deoxypactamycin产生，也增强寡霉素A与B的产量，且具暴露时间依赖性。

讨论总结：研究人员指出TUA-HK1GM在表型与系统发育上区别于S. griseoruber，应为新物种；其无NaCl时主产寡霉素B，加NaCl后激活寡霉素A与7-deoxypactamycin产生，寡霉素B也进一步增加，此为高浓度NaCl显著诱导链霉菌抗生素产生的首例报道。可能的机制涉及NaCl提升前体供给、影响酶促反应或调控因子活性；olm与ptm BGC共存但NaCl对二者协同激活的机制不同于已知的oligomycin与avermectin互调机制，LC-MS显示NaCl还影响其他次级代谢产物丰度，说明NaCl对该株次级代谢具广泛重编程效应。kusaya gravy作为高盐、复杂微生物与有机物共存的特异生境，可能驱动分离株演化出NaCl响应型次级代谢激活策略；此类简单理化因子（NaCl）诱导沉默BGC（silent biosynthetic gene cluster）表达的方法可为新抗生素挖掘提供简便途径。NaCl激活的具体调控机制及是否普遍适用于其他kusaya来源或环境链霉菌尚需后续研究。研究意义在于揭示高盐发酵食品来源链霉菌的新颖代谢调控特征，并为以环境因子诱导次级代谢产物（secondary metabolite）提供实证。