《Journal of Biomedical Materials Research Part A》：Reciprocal Macrophage-MSC Crosstalk Drives Immunomodulatory and Regenerative Phenotypes in a Mineralized Collagen Scaffold
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临界尺寸的颅颌面骨缺损不能自然愈合，并且通常表现出限制再生的慢性炎症反应。越来越明显的是，生物材料必须促进免疫细胞（如巨噬细胞）与骨祖细胞之间的动态串扰，以解决炎症并加速再生。在这里，研究人员评估了中性（M0）或促炎（M1）状态的巨噬细胞与在矿化胶原支架内的基
临界尺寸的颅颌面骨缺损不能自然愈合，并且通常表现出限制再生的慢性炎症反应。越来越明显的是，生物材料必须促进免疫细胞（如巨噬细胞）与骨祖细胞之间的动态串扰，以解决炎症并加速再生。在这里，研究人员评估了中性（M0）或促炎（M1）状态的巨噬细胞与在矿化胶原支架内的基础或许可状态下的间充质干细胞（MSCs）之间的相互作用。研究揭示了MSC-巨噬细胞串扰影响骨祖细胞分化和免疫细胞极化的显著变化。值得注意的是，MSCs和巨噬细胞之间的串扰驱动早期炎症反应，通过分泌IL-6增强MSC的免疫调节活性，这种效应对于已经许可的MSC更为显著。共培养中巨噬细胞的存在上调了基础MSC组中的成骨（ALPL、BMP2、COL1A2和RUNX2）和血管生成基因（ANGPT1）。此外，MSC-巨噬细胞相互作用随后在培养7天后驱动M2样巨噬细胞极化增加，如表面标志物表达所示。这些发现表明，生物材料支架可以作为MSC介导的免疫调节的媒介，重点在于实现早期促炎表型，从而驱动后续的巨噬细胞极化和再生能力增强的标志物。
**论文解读文章**
**研究背景**
临界尺寸的颅颌面（craniomaxillofacial，CMF）骨缺损（>25 mm）因形状不规则且无法自然愈合，常表现为慢性炎症，阻碍再生。当前自体或异体移植存在供区并发症、可用性有限等问题。组织工程策略试图通过生物材料招募内源性干细胞促进骨再生，但损伤后的早期炎症状态以及植入材料内炎症细胞（如巨噬细胞）与骨祖细胞间的相互串扰（crosstalk）可能显著影响再生潜能。巨噬细胞在炎症阶段发挥关键作用，其表型可从促炎（M1）向修复型（M2）转变。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有免疫调节能力，经炎症因子（IFN-γ（干扰素-γ）和TNF-α（肿瘤坏死因子-α））许可（licensed）后可分泌PGE2（前列腺素E2）、IL-6（白细胞介素-6）等因子，调控免疫细胞功能。然而，在模拟骨的微环境中，临床相关的原代巨噬细胞与MSCs之间的双向串扰尚未被系统研究。研究人员此前开发的矿化胶原支架（mineralized collagen scaffold）能促进MSC成骨分化及体内骨形成，且支架的蛋白聚糖组成和孔各向异性可调节MSC表型。本研究旨在通过直接共培养，探究不同初始状态的巨噬细胞（M0 vs M1）与MSCs（基础 vs 许可）在该支架中的相互作用，以阐明驱动免疫调节和再生表型的机制。论文发表在《Journal of Biomedical Materials Research Part A》。
**关键技术方法**
研究人员采用冻干法制备含排列孔的矿化胶原-糖胺聚糖支架（矿化胶原前体悬液含I型牛胶原、磷酸/氢氧化钙缓冲液、硫酸软骨素-6（CS6），通过定向冰晶升华形成多孔网络）。细胞来源包括：人骨髓间充质干细胞（hMSCs，来自20岁非裔美国女性）和原代人外周血单核细胞（STEMCELL Technologies）分化的巨噬细胞。主要技术方法为：1）细胞共培养：将基础/许可的hMSCs与M0/M1巨噬细胞以1:3比例接种于支架，培养7天；2）流式细胞术（flow cytometry）：检测M1标志CD80和M2标志CD206的表达；3）ELISA（酶联免疫吸附试验）：定量检测分泌因子OPG（骨保护素）、PGE2、IL-6、IDO1（吲哚胺2,3-双加氧酶1）、CCL22；4）NanoString基因表达分析：使用两个定制探针组分别评估MSC成骨/血管生成/免疫调节基因（38个）及巨噬细胞表型基因（72个），数据经内参和Day0对照归一化后以log2倍变表示。
**研究结果**
**3.1 M1巨噬细胞增强MSC共培养中OPG和IL-6的表达**
通过ELISA检测发现，基础MSC共培养组中，M1巨噬细胞的存在在培养第1天和第3天显著提高了OPG分泌（p<0.05），而MSC许可状态则增强了第1天的PGE2分泌。M1巨噬细胞共培养显著提高了IL-6分泌（p<0.05），但MSC许可反而在培养第7天降低了IL-6水平。结果表明，巨噬细胞初始表型显著影响MSC的成骨和免疫调节分泌谱。
**3.2 初始MSC许可状态主导MSC的下游基因表达**
NanoString分析显示，MSC许可状态对成骨基因（ALPL（碱性磷酸酶）、COL1A2（I型胶原α2链）、IGF2（胰岛素样生长因子2））和血管生成基因（ANGPT1（血管生成素1））的表达具有主导性抑制效应（p<0.05），而巨噬细胞共培养则在基础MSC组中上调这些基因（ALPL、BMP2（骨形态发生蛋白2）、COL1A2、RUNX2（Runt相关转录因子2）、ANGPT1）。进一步分析揭示了巨噬细胞在早期阶段驱动许可MSC的成骨反应，而在后期基础MSC中则表现出更广泛的成骨上调。
**3.3 巨噬细胞基因表达受初始极化状态和MSC许可的共同塑造**
巨噬细胞特异性基因分析显示，许可MSCs共培养显著增强了M1相关基因（CCL8、TNF（肿瘤坏死因子）、IL1B（白细胞介素1β）、CD80）和M2a相关基因（CCL18）的表达。初始M0巨噬细胞与MSCs共培养后，促炎基因（CCL8、IL1B）上调；而初始M1巨噬细胞则高表达生长调节基因BTG1和M2样基因CCL18，提示MSC共培养可加速M1向M2的转变。
**3.4 巨噬细胞在矿化胶原支架上随时间呈现增强的M2样表面标志物表达**
流式细胞术检测发现，M0巨噬细胞在支架上培养第1天和第3天的CD206（M2标志）表达显著高于M1组（p<0.05）。无论MSC许可状态如何，M0与MSCs共培养的巨噬细胞在所有时间点的CD206表达均高于M1组。随时间推移，CD206+细胞比例增至50%–80%，CD80+细胞仅3%–6%，且MSC许可状态未显著改变表面标志物表达模式。这表明支架环境中巨噬细胞呈现时间依赖性的M2极化倾向。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究利用矿化胶原支架这一标准化3D平台，揭示了MSC与巨噬细胞间的双向串扰是塑造早期炎症反应和后续免疫调节/再生表型的关键。基础MSC展现出更强的成骨潜力（高OPG、成骨基因），而许可MSC则通过PGE2和早期IL-6分泌驱动免疫调节。巨噬细胞共培养可上调MSC的成骨和血管生成基因，同时促进M1相关基因的瞬时激活并随后向M2表型转变。表面标志物分析证实了时间依赖性的M2极化模式，尤其是M0起始组转变更快。研究认为，设计能快速诱导促炎巨噬细胞极化的生物材料平台，可能有利于后续MSC介导的免疫调节和成骨活性，进而促进再生修复。然而，本研究存在单供体细胞限制，未来需评估供体变异性。
**研究结论翻译**
MSC与巨噬细胞的相互作用在寻找调节伤口微环境和骨修复质量与动力学的策略中日益受到关注。研究人员在此探索了在矿化胶原生物材料内，初始处于基础或许可状态的人MSCs与中性或促炎状态的原代人巨噬细胞直接共培养的影响。研究显示，MSC的成骨和免疫调节反应以及巨噬细胞极化动力学不仅受MSC或巨噬细胞初始状态的强烈影响，还受这两种群体在胶原生物材料内相互作用的强烈影响，且这一过程在短短7天内即可发生。值得注意的是，初始MSC许可状态是塑造MSC和巨噬细胞反应的重要因素。起初，基础MSC展现出更强的成骨反应，而炎症许可的MSC则表现出强大的免疫调节反应。然而，随着培养时间的推移，巨噬细胞的存在负责塑造再生基因表达的显著变化。此外，尽管在矿化胶原支架上培养的巨噬细胞最初显示出采纳促炎表型的迹象，但与MSCs共培养进一步上调了这一表型，且对于已被炎症刺激许可的MSCs效果最为显著。有趣的是，巨噬细胞的促炎状态随时间减弱，表明在矿化胶原支架内，巨噬细胞表型向更具修复性的方向转变。这项研究扩展了研究人员对MSC-巨噬细胞相互作用的理解，并揭示了利用这种关系改进生物材料设计的机会。
