用于糖尿病创面加速再生的谷胱甘肽(Glutathione)控释多功能甲基丙烯酸明胶(Gelatin Methacryloyl, GelMA)/壳聚糖(Chitosan)/沸石(Zeolite)水凝胶

《Journal of Biomedical Materials Research Part A》：Controlled Glutathione-Releasing Multifunctional Gelatin Methacryloyl/Chitosan/Zeolite Hydrogels for Accelerated Regeneration in Diabetic Wounds

　　

摘要：慢性糖尿病创面因持续炎症、过度氧化应激、血管生成受损及高感染易感性仍是重大临床难题。本研究旨在开发一种由甲基丙烯酸明胶(Gelatin Methacryloyl, GelMA；7.5%、10%、15% w/v)、壳聚糖(Chitosan, 2% w/v)、沸石(Zeolite, 1% w/v)及谷胱甘肽(Glutathione, 0.15 mg/mL)组成的多功能水凝胶体系(Gel-CZG)，可同时在糖尿病创面中发挥抗氧化治疗、预防感染及支持组织再生的作用。所有Gel-CZG水凝胶均表现出类固体的黏弹性和剪切变稀(Shear-thinning)特性，且GelMA浓度升高会使刚度增加。傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FTIR)分析证实了谷胱甘肽、壳聚糖和沸石的成功掺入。扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope, SEM)成像显示其具有高度连通的多孔微结构，孔径随GelMA浓度增加而减小。谷胱甘肽可持续释放达21天，遵循扩散控释机制。该水凝胶具有细胞相容性，支持成纤维细胞黏附与增殖，并能以浓度依赖方式调控关键炎症因子(如IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP13)与再生相关基因(如IGF1、COL1A1)的表达。所有配方对大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的抗菌率＞90%，并使铜绿假单胞菌生物膜形成抑制率≥95%。综上，所设计的Gel-CZG水凝胶提供了一个稳健且可调的平台，集成了谷胱甘肽持续递送、抗菌作用及再生支持功能。

一、研究背景与意义

糖尿病足溃疡(Diabetic Foot Ulcers, DFUs)等慢性糖尿病创面因高血糖引发的晚期糖基化终末产物(Advanced Glycation End Products, AGEs)积累，导致持续性慢性炎症、活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)过量产生、氧化应激损伤、血管功能受损、血管生成减少及细胞增殖与细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)重塑障碍，加之高糖环境易致细菌感染及多重耐药菌株出现，使创面难以愈合，常需截肢甚至危及生命。现有临床手段（清创、植皮、高级敷料等）多为对症处理，无法纠正分子与细胞层面的微环境紊乱。因此亟需能同时调控创面微环境、促进有效组织再生的先进治疗策略。

水凝胶(Hydrogel)因其三维亲水结构可吸收渗液、维持湿润生理平衡环境而备受关注；天然高分子基水凝胶如壳聚糖(Chitosan)具止血、广谱抗菌及生物相容性，但其力学稳定性差、易快速溶胀溶解；甲基丙烯酸明胶(Gelatin Methacryloyl, GelMA)保留精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)细胞黏附 motif且具光交联可调力学性能，可提供仿ECM微环境。沸石(Zeolite, 硅铝酸盐微孔晶体)具高比表面积、离子交换能力，可辅助抗菌、吸附ROS并作为治疗剂控释储库。还原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)是维持细胞氧化还原稳态的重要内源性抗氧化剂，可清除ROS、减轻氧化与炎症损伤。既往含GSH或含沸石的水凝胶多聚焦单一功能，缺乏力学-抗菌-抗氧化-促再生的一体化设计。

为此，研究人员开发了将GelMA、壳聚糖、沸石与谷胱甘肽整合于单一可光交联复合水凝胶(Gel-CZG)的多功能平台，系统考察不同GelMA浓度(7.5%、10%、15% w/v，壳聚糖固定2% w/v、沸石固定1% w/v、谷胱甘肽固定0.15 mg/mL即500 μM)对理化性质、谷胱甘肽释放、细胞相容性、基因表达调控及抗菌/抗生物膜性能的影响，以明确结构-性能-功能关系，为糖尿病慢性创面管理提供潜在临床转化方案。该论文发表于《Journal of Biomedical Materials Research Part A》。

二、主要关键技术方法

研究人员采用的主要关键实验技术方法包括：(1) 合成GelMA（猪皮A型明胶与甲基丙烯酸酐反应后透析冻干）；(2) 制备三种GelMA浓度梯度的Gel-CZG复合水凝胶前体液（含壳聚糖、沸石、谷胱甘肽及光引发剂LAP），经405 nm紫外光交联固化；(3) 流变学测试（频率扫描、温度扫描、流动扫描）表征黏弹性及剪切变稀行为；(4) 傅里叶变换红外光谱(FTIR)与扫描电子显微镜(SEM)表征化学组成与多孔微观形貌并量化孔径；(5) 压缩试验测弹性模量，PBS中测溶胀率与降解率；(6) UV-Vis分光光度法检测谷胱甘肽体外累积释放曲线；(7) MTS法检测谷胱甘肽对L929小鼠成纤维细胞毒性及水凝胶浸提/接触培养下的细胞活力，荧光显微镜(DAPI核染)观察细胞黏附分布；(8) RT-PCR检测炎症(IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP13)与再生相关基因(IGF1、VEGF、COL1A1、IL-10)，以GAPDH为内参采用2^?ΔΔCt法分析；(9) 改良微量稀释法测对E. coli、S. aureus、P. aeruginosa的抑菌率，结晶紫(Crystal Violet, CV)染色法测P. aeruginosa PA01生物膜抑制率；所有实验设n=3重复，统计学用单因素/双因素ANOVA加Tukey事后检验，p<0.05为差异显著。

三、研究结果

3.1 流变学表征(Rheological Characterization)

通过频率扫描发现所有配方G′（储能模量）＞G″（损耗模量），证实已形成交联网络且具有类固体黏弹性；GelMA浓度越高G′、G″越大，Gel15-CZG最高，表明网络密度与刚度随GelMA升高而增加。温度扫描显示Gel15-CZG在约24℃出现G′/G″交叉点（溶胶-凝胶转变），低浓度组未出现明显交叉。流动扫描显示所有配方具剪切变稀行为，粘度随剪切速率升高而下降，Gel15-CZG粘度最高。结论：Gel-CZG水凝胶具稳定黏弹性与可注射性（剪切变稀），GelMA浓度可调控刚度与流变性。

3.2 傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform Infrared Spectroscopy)

各纯组分特征峰（谷胱甘肽的C=O、酰胺I、S-H；沸石的Si-O-Al、T-O-T振动；壳聚糖O-H/N-H、酰胺I、C-O-C；GelMA酰胺I/II/III及宽O-H/N-H峰）均在复合水凝胶谱图中被保留并伴有轻微位移与强度变化，3200–3400 cm^?1处O-H/N-H伸缩峰展宽提示GelMA、壳聚糖和谷胱甘肽间形成大量氢键，酰胺带强度降低提示壳聚糖正电荷与沸石框架可能存在静电相互作用。结论：FTIR证实谷胱甘肽、壳聚糖、沸石成功并入GelMA基质并形成分子间相互作用。

3.3 形态学分析(Morphological Analysis)

SEM显示所有Gel-CZG水凝胶具高度连通均匀多孔结构，表面可见颗粒状沸石。平均孔径随GelMA浓度升高显著减小：Gel7.5-CZG为108.2±1.4 μm，Gel10-CZG为54.5±1.4 μm，Gel15-CZG为41.1±3.8 μm，归因于高浓度下较高前体粘度与交联密度限制冰晶生长。结论：GelMA浓度可精确调控孔隙率，较低浓度利于细胞迁移与血管新生，较高浓度助保湿与控释。

3.4 力学表征(Mechanical Characterization)

压缩试验显示最大压缩应力随GelMA升高而增大（Gel7.5-CZG≈47 kPa，Gel10-CZG≈55 kPa，Gel15-CZG≈65 kPa），但弹性模量呈非线性：Gel7.5-CZG≈70 kPa，Gel10-CZG≈120 kPa（最高），Gel15-CZG回落至≈85 kPa；最大应变Gel7.5-CZG最大(≈58%)，Gel10-CZG最脆(≈39%)，Gel15-CZG中等(≈50%)。结论：Gel10-CZG具最佳刚度与适度延展性平衡，适合需力学保护与适应皮肤形变的创面。

3.5 溶胀与降解行为(Swelling and Degradation Behavior)

所有配方初期(0–60 min)快速吸水，随后趋平衡；12 h溶胀率Gel7.5-CZG≈500%最高，Gel15-CZG≈365%最低，反映交联密度增高限制吸水。降解试验显示随时间依赖性质量损失加速（56 h后加快），240 h约失重50%；Gel15-CZG降解最慢，Gel7.5-CZG与Gel10-CZG较快。结论：Gel10-CZG在吸液能力与结构稳定性间取得较好平衡。

3.6 体外谷胱甘肽释放曲线(In Vitro Glutathione Release Profile)

谷胱甘肽标准曲线线性良好(R²=0.9965)。所有配方呈初期突释（前72 h）后续21天(504 h)扩散控释达到近100%累积释放；不同GelMA浓度间释放曲线相似，表明7.5%–15% GelMA范围内谷胱甘肽释放主要受扩散控释机制主导，受聚合物浓度影响较小。结论：Gel-CZG可实现长达21天持续谷胱甘肽递送，为创面提供长期抗氧化微环境。

3.7 谷胱甘肽对L929细胞的细胞毒性评估(Evaluation of the Cytotoxicity of Glutathione on L929 Cells)

50–500 μM谷胱甘肽处理24 h后L929细胞活力均≥100%（500 μM组≈116%），无细胞毒性。据此选500 μM(0.15 mg/mL)为水凝胶加载浓度。结论：所选谷胱甘肽浓度安全且具有促细胞活力趋势。

3.8 体外细胞培养与细胞毒性分析(In Vitro Cell Culture and Cytotoxicity Analysis)

水凝胶表面接种L929细胞，第1天活力低于2D对照（细胞适应期），第3天升至最高（Gel7.5-CZG≈108%，Gel10-CZG≈104%，Gel15-CZG≈98%），第7天略降（代谢废物累积）。荧光显微镜(DAPI)显示各组成活细胞黏附铺展，Gel7.5-CZG与Gel10-CZG因较大孔隙荧光信号更强更均匀，Gel15-CZG较致密孔隙限制细胞长入。结论：所有Gel-CZG水凝胶具良好细胞相容性并支持成纤维细胞黏附增殖，低–中GelMA浓度更有利细胞-材料交互。

3.9 抗氧化与炎症基因表达响应的调控(Modulation of Antioxidant and Inflammatory Gene Expression Responses)

与2D对照组相比，Gel-CZG水凝胶培养下促炎基因(IL-1β、TNF-α、IL-6)与基质金属蛋白酶MMP13下调，Gel7.5-CZG还显著上调胰岛素样生长因子1(IGF1)表达，显示最均衡的抗炎-促再生表型；Gel10-CZG在某些时间点IL-1β偏高提示较强氧化炎症激活；Gel15-CZG虽部分抑制炎症基因但同时下调ECM相关(COL1A1)与生长因子基因。血管内皮生长因子(VEGF)在各配方均下调，归因于持续GSH强效清除ROS削弱需低水平ROS介导的VEGF信号("抗氧化悖论")。结论：Gel7.5-CZG最有利于减轻ROS介导炎症并促进再生相关基因表达，GelMA浓度需优化以平衡ROS调控、炎症抑制与组织再生。

3.10 抗菌与生物膜抑制测试(Antibacterial Activity and Biofilm Inhibition Testing)

所有Gel-CZG配方对E. coli、S. aureus及P. aeruginosa抗菌率＞90%；对P. aeruginosa PA01生物膜形成抑制率≥95%，归因于壳聚糖膜破坏作用、沸石吸附群体感应(Quorum Sensing, QS)信号分子及谷胱甘肽微环境酸化协同效应。结论：复合水凝胶具强效广谱抗菌及抗生物膜能力，适合感染风险高的慢性糖尿病创面。

四、讨论与结论总结（翻译结论部分）

讨论指出本研究局限性包涵体外L929细胞无法完全模拟糖尿病创面高糖/AGEs累积/巨噬细胞功能失调的微环境，未来将在高糖条件、巨噬细胞共培养及糖尿病动物模型中进行验证。

结论翻译（研究人员原文结论浓缩直译）：

在本研究中，研究人员成功设计并表征了一种将谷胱甘肽(Glutathione)、壳聚糖(Chitosan)和沸石(Zeolite)整合入可调甲基丙烯酸明胶(GelMA)基质中的多功能复合水凝胶，以解决糖尿病创面的复杂微环境问题。Gel-CZG水凝胶表现出良好的黏弹行为、可调刚度及适合临床操作与潜在可注射应用的剪切变稀特性。FTIR证实了复合网络的结构完整性与组分相容性，谷胱甘肽的持续释放确保了长达21天的连续抗氧化保护。该水凝胶具优异细胞相容性，有效抑制炎症基因标志物并促进成纤维细胞再生信号。此外，对E. coli、S. aureus和P. aeruginosa的强大抗菌活性表明该系统适用于感染倾向性慢性创面。值得注意的是，Gel10-CZG配方被确定为平衡配方，在不牺牲功能性的前提下提供了力学回弹性、细胞相容性及生物活性调控能力。这些发现证明优化GelMA浓度是实现既能保护又可主动修复糖尿病创面微环境的多功能水凝胶的关键。抗氧化递送、抗菌活性与促再生功能的协同组合使Gel-CZG水凝胶成为糖尿病创面管理的 promising生物材料。其可调力学轮廓、微环境调控能力及临床转化潜力使之成为下一代创面敷料的强有力候选者。未来研究将聚焦于体内评价及治疗应用的大规模优化。