《Journal of Cell Communication and Signaling》：Multi-omics analysis identifies a major histocompatibility complex class II-associated antigen-presenting cancer-associated fibroblast-like state linked to the nuclear factor erythroid 2-related factor 2-karyopherin subunit beta 1 axis in nonsmall cell lung cancer
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为了明确非小细胞肺癌（NSCLC）中一种抗原提呈的癌相关成纤维细胞（CAF）样状态的转录特征、空间分布和免疫相关特性，并评估其与核因子E2相关因子2（NRF2）-核转运蛋白亚基β1（KPNB1）轴的关系，研究人员进行了整合单细胞RNA测序、空间转录组学和批量转
为了明确非小细胞肺癌（NSCLC）中一种抗原提呈的癌相关成纤维细胞（CAF）样状态的转录特征、空间分布和免疫相关特性，并评估其与核因子E2相关因子2（NRF2）-核转运蛋白亚基β1（KPNB1）轴的关系，研究人员进行了整合单细胞RNA测序、空间转录组学和批量转录组学数据的多组学分析。功能验证使用了来自NSCLC患者的原代CAF，包括NRF2扰动、KPNB1敲低、T细胞共培养实验，以及使用基于抗程序性细胞死亡蛋白1（anti-PD-1）组合治疗的同种原位小鼠肺癌模型。在NSCLC中鉴定出一种主要组织相容性复合体II类（MHC-II）相关的抗原提呈CAF样（apCAF样）状态。该状态显示出增加的抗原提呈相关分子、有限的共刺激分子表达，以及涉及MHC-II、转化生长因子-β和C-X-C基序趋化因子配体通路的推断通讯。较高的KPNB1表达与较差的生存、较低的免疫浸润和较低的ImmuneScore相关。在原代CAF中，NRF2激活增加KPNB1并降低II类MHC反式激活因子（CIITA）、主要组织相容性复合体II类DRα（HLA-DRA）和MHC-II相关信号，而NRF2抑制则表现出相反的模式。KPNB1低表达的CAF增强了T细胞活化和细胞因子释放，KPNB1敲低富集了抗原提呈相关的转录程序。在体内，抑制NRF2-KPNB1轴增强了对抗PD-1的反应。NSCLC包含一种与NRF2-KPNB1轴相关并对PD-1阻断反应改变的MHC-II相关的apCAF样状态。
非小细胞肺癌（NSCLC）是全球癌症发病和死亡的主要原因之一，免疫检查点抑制剂虽改善了部分患者的预后，但总体缓解率不足30%，且原发性和获得性耐药以及免疫排斥现象普遍。肿瘤微环境（TME）中的非恶性成分，尤其是癌相关成纤维细胞（CAF），被认为在细胞外基质重塑、炎症调节和免疫抑制中发挥关键作用。以往研究多聚焦于CAF通过分泌转化生长因子-β（TGF-β）和白介素-6（IL-6）等免疫抑制介质来限制免疫细胞浸润和活化。然而，单细胞技术的进展揭示了CAF的转录异质性和可塑性，其中一种表达主要组织相容性复合体II类（MHC-II）相关分子的CAF状态，即抗原提呈CAF（apCAF），在泛癌分类中被识别为独特的转录亚型。但该状态在NSCLC中的普遍性、转录定义、空间分布及其免疫学后果尚未明确。此外，核因子红细胞2相关因子2（NRF2）作为氧化应激反应的核心转录调节因子，可能影响CAF表型；核转运蛋白亚基β1（KPNB1）作为核转运蛋白，可能通过调控II类MHC反式激活因子（CIITA）等转录因子的核质转运而影响MHC-II表达。为此，本研究整合多组学方法，旨在鉴定NSCLC中MHC-II相关的apCAF样状态，定义其转录和空间特征，并评估NRF2-KPNB1轴与此状态及抗程序性细胞死亡蛋白1（anti-PD-1）治疗反应的关系。研究发表于《Journal of Cell Communication and Signaling》。
研究采用的主要关键技术方法包括：对公共单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集GSE131907（包含NSCLC肿瘤及邻近正常组织）进行细胞聚类和CAF亚群分析；利用空间转录组数据集E-MTAB-13530进行空间聚类和组织定位；使用癌症基因组图谱（TCGA）肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌（LUSC）队列（共1026例样本）进行生存及免疫评分分析；从150例NSCLC手术标本中分离原代CAF进行功能验证；通过CRISPR激活（CRISPRa）和小干扰RNA（siRNA）扰动NRF2、siRNA敲低KPNB1、CD8
+ T细胞共培养及Transwell实验评估免疫效应；利用同种原位小鼠Lewis肺癌模型（C57BL/6J小鼠）进行体内干预。
研究结果如下：
3.1 转录鉴定NSCLC中MHC-II相关的成纤维细胞状态及其推断的免疫互作特征：通过scRNA-seq分析GSE131907，对成纤维细胞再聚类后得到10个亚簇（Cluster 0–9），其中Cluster 7具有较高apCAF特征评分，高表达HLA-DRA、CD74等MHC-II相关基因，被定义为apCAF样群体。该群体相比其他CAF亚型具有更高的抗原加工和呈递模块评分，基因本体（GO）富集分析显示上调基因主要与抗原加工呈递、T细胞活化调节等有关。CellChat分析表明，在MHC-II信号网络中，apCAF样群体显示朝向T淋巴细胞的推断通讯边，而炎性CAF（iCAF）、肌成纤维细胞CAF（myCAF）和正常成纤维细胞未见此模式。
3.2 CAF状态的伪时间分布及相关基因表达动态：Monocle 2伪时间分析显示apCAF样群体主要位于CAF状态转变轨迹的末端分支。基因表达趋势显示ACTA2早期升高后下降，CD74在中期至晚期再次升高，IRF1在晚期显著上升，NFE2L2在后期呈温和上升趋势，KPNB1在整个轨迹中变化不大。
3.3 KPNB1表达与NSCLC生存结局的关联：TCGA LUAD/LUSC队列中，高KPNB1组总生存率低于低表达组（p=0.008）。Cox比例风险分析显示病理T分期和N分期仍为生存的主要决定因素。单细胞表达模式显示KPNB1在肿瘤样本中多个细胞类型（上皮细胞、成纤维细胞、髓系细胞、NK细胞）中总体升高。
3.4 apCAF样群体中MHC-II相关的通讯特征及有限的共刺激分子表达：CellChat分析显示apCAF样群体在MHC-II信号通路中具有较高的发送者和影响者中心性，推断其与T细胞、B细胞、髓系细胞和NK细胞存在MHC-II、TGF-β和C-X-C基序趋化因子配体（CXCL）信号通讯。apCAF样群体对CD80、CD86等共刺激分子表达低于髓系细胞和B淋巴细胞，CD40、ICOSLG、TNFSF4、TNFSF9也普遍低表达。
3.5 apCAF样群体中的干扰素应答和抗原呈递相关转录程序：基因集富集分析（GSEA）显示apCAF样群体相对于其他CAF亚型显著富集干扰素γ应答、抗原加工和呈递、同种异体排斥和炎症应答等通路。
3.6 KPNB1表达与免疫浸润和免疫评分的负相关：基于ssGSEA和ESTIMATE分析，KPNB1表达与多种免疫细胞亚群（B细胞、未成熟树突状细胞、肥大细胞、浆细胞样树突状细胞、T细胞、细胞毒性细胞、树突状细胞、CD8
+ T细胞、TH1细胞、滤泡辅助T细胞）的浸润评分呈负相关，与ImmuneScore亦呈负相关（p<0.001）。
3.7 KPNB1相关点的空间分布及其与免疫标志物的关联：空间转录组分析显示KPNB1高表达点在组织切片中呈空间聚集分布（Ripley's K曲线高于基线）。双变量Moran's I分析显示CD8A与ITGAX（树突状细胞标志物）之间存在弱正空间自相关（p=0.001）。CXCL12高与KPNB1高点在部分区域重叠。
3.8 KPNB1关联空间模块和抗原呈递信号的区域富集：点图显示特定空间亚簇富集KPNB1、CAF相关标志物及MHC-II相关基因（HLA-DRA、HLA-DRB1）。空间映射显示KPNB1相关信号和NRF2相关及抗原呈递相关信号在部分区域存在重叠。
3.9 NRF2活性、KPNB1表达与CAF中MHC-II相关分子的关系：在原代CAF中，CRISPRa激活NRF2增加KPNB1 mRNA，降低CIITA和HLA-DRA mRNA；siRNA敲低NRF2则相反。蛋白水平上，NRF2激活增加KPNB1并减少HLA-DRα。流式细胞术显示NRF2激活降低MHC-II阳性CAF比例，而siNRF2增加该比例（均p<0.001）。
3.10 KPNB1低表达CAF增强T细胞活化和细胞因子释放：与对照及KPNB1高表达CAF相比，KPNB1低表达CAF与CD8
+ T细胞共培养后，CD69
+CD25
+ T细胞比例更高（分别为29.3%、19.4%和15.5%），上清中干扰素γ（IFN-γ）及另一种细胞因子水平显著升高。Transwell实验显示接触条件下IFN-α水平高于非接触条件（p<0.01），提示接触依赖性成分。
3.11 KPNB1敲低后的转录组改变及抗原呈递相关通路富集：KPNB1敲低后bulk RNA-seq鉴定出725个上调基因和606个下调基因。GO和KEGG富集分析显示上调基因主要富集于抗原加工和呈递等相关功能项。GSEA显示MHC II类抗原呈递基因集在KPNB1敲低下呈正富集（标准化富集分数1.348，错误发现率0.159）。
3.12 NRF2-KPNB1轴抑制与抗PD-1治疗反应：在同种原位Lewis肺癌模型中，与对照组和抗PD-1单药组相比，Importazole（KPNB1抑制剂）+抗PD-1和siNRF2+抗PD-1组肿瘤生长更慢，生存曲线右移，而CDDO-Me（NRF2激活剂）+抗PD-1组接近对照。免疫组化定量显示Importazole+抗PD-1和siNRF2+抗PD-1组中MHC-II阳性CAF比例显著高于对照和抗PD-1单药组。
讨论部分总结：本研通过整合多组学分析，在NSCLC中鉴定并表征了具有MHC-II相关转录特征的apCAF样状态。该状态高表达抗原呈递相关分子但共刺激分子有限，与NRF2-KPNB1轴相关，且与较低的免疫浸润及抗PD-1治疗反应改变有关。这些结果与既往发现一致，即在多种肿瘤类型中MHC-II相关CAF状态构成一个相对独特的转录类别。本研究中apCAF样状态位于CAF状态转变轨迹的末端分支，支持其代表CAF异质性谱系中一可区分分支的观点。然而，与某些胃癌或泛癌背景下apCAF丰度与免疫治疗敏感性正相关的报道不同，本研究中的apCAF样状态更符合MHC-II相关但共刺激受限的表型，而非功能性抗原呈递细胞。单独表达MHC-II分子不足以定义功能性方向，局部组织结构和并行信号线索可能至关重要。NRF2激活对应KPNB1升高及CIITA、HLA-DRA和MHC-II阳性细胞比例下降，NRF2抑制则相反，表明在CAF中NRF2-KPNB1轴更倾向于限制MHC-II程序并维持耐受表型。CellChat分析提示apCAF样状态参与MHC-II、TGF-β和CXCL通讯但缺乏共刺激分子，这与不完全抗原呈递状态相符。在TCGA队列中高KPNB1与低ImmuneScore和较差生存相关，而在CAF内部分析中低KPNB1对应高MHC-II分子表达和强T细胞功能，表明从不同分析尺度观察到同一免疫表型转换。从转化角度，Importazole或siNRF2联合抗PD-1与肿瘤生长减慢、生存延长和MHC-II阳性CAF比例增加相关，而CDDO-Me无此效应，提示NRF2-KPNB1轴可能是可靶向的CAF相关节点，为通过CAF表型重塑增强PD-1阻断提供了前临床依据。
研究结论：NSCLC包含一种与NRF2-KPNB1轴相关并对PD-1阻断反应改变的MHC-II相关apCAF样状态。该发现支持CAF靶向策略应从广泛清除转向功能重编程，并为进一步机制和转化研究提供了基础。
