《Journal of Cell Communication and Signaling》：Species-specific roles of cellular communication network proteins in cartilage development: A comparative study using in vitro chondrogenic models
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细胞通讯网络（CCN）蛋白是软骨发育的关键基质细胞调节因子，然而其物种特异性作用和网络水平背景仍不清楚。本研究整合了来自鸡胚和鼠胚肢体芽微团培养以及人间充质干细胞软骨形成的bulk RNA测序，结合共表达、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）和直系同源（ortho
细胞通讯网络（CCN）蛋白是软骨发育的关键基质细胞调节因子，然而其物种特异性作用和网络水平背景仍不清楚。本研究整合了来自鸡胚和鼠胚肢体芽微团培养以及人间充质干细胞软骨形成的bulk RNA测序，结合共表达、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）和直系同源（ortholog）分析，跨模型构建了以CCN为中心的调控网络。CCN1和CCN2成为主导性保守枢纽，富集于含胶原的细胞外基质、软骨发育和生长因子信号模块，而CCN3-CCN6则显示较低且依赖上下文的表达和连接性。功能与直系同源分析揭示了中等的通路保守性，其中IGF、EGFR和HIF-1信号高度保守，但在低氧和机械感知/Hippo类别中重叠减少，表明环境感知的物种特异性调控。定向直系同源筛选鉴定了多功能保守枢纽，包括COL2A1、TGFBR1、SMAD3、RUNX2、HIF1A、IGF1、SPP1和CD44。对人iPSC来源软骨形成和胚胎肢体数据集的单细胞RNA-seq荟萃分析显示，CCN1/2表达和同源网络活性在间充质和早期软骨细胞群体中达到峰值，与体内肥大和骨化阶段的模型依赖性持续一致。总体而言，这项研究定义了一个保守的以CCN1/2为中心的轴，整合了细胞外基质形成与生长因子和机械信号，为模型选择和靶向CCN的软骨再生策略提供了框架。
本研究背景涉及骨关节炎等肌肉骨骼疾病导致的软骨再生能力有限问题。软骨形成是一个复杂过程，CCN家族（6个成员）作为基质细胞蛋白是关键调节因子，但其物种特异性作用及网络水平背景尚不明确。现有体外模型（鸡胚、鼠胚微团培养、人间充质干细胞）虽各自贡献显著，但缺乏跨物种整合分析。研究人员为此结合了bulk RNA-seq（鸡胚数据来源PRJNA817177、PRJNA938813；人MSC数据来源GSE109503；鼠胚微团为自行培养并测序，数据上传PRJNA1421121）、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、PPI网络构建（STRING数据库，阈值0.4）、直系同源映射以及单细胞RNA-seq荟萃分析（人iPSC来源软骨形成GSE160787、人胚胎肢体公共数据、鼠胚胎肢体GSE142425），构建了多物种的CCN中心调控网络。主要结论：CCN1和CCN2在所有模型中均为高度保守的核心枢纽，富集于细胞外基质、软骨发育及生长因子信号模块；CCN3-CCN6则呈现低表达和模型依赖性。通路保守性中等，IGF、EGFR、HIF-1信号高度保守，但低氧和机械感知/Hippo类别存在物种特异性扩展。通过直系同源筛选鉴定了多功能枢纽（COL2A1、TGFBR1、SMAD3、RUNX2、HIF1A、IGF1、SPP1、CD44）。单细胞分析显示CCN1/2表达及网络活性在间充质和早期软骨细胞中最高，体内胚胎肢体数据证实其在成熟软骨及骨化阶段持续活跃。该研究定义了保守的CCN1/2中心轴，为模型选择及靶向CCN的软骨再生策略提供了框架。该论文发表于《Journal of Cell Communication and Signaling》。
**转录组分析揭示体外软骨形成模型的转录谱**
通过主成分分析（PCA）对三种模型进行转录组学分析，研究人员发现所有模型均随分化时间呈现稳健的转录组变化轨迹，鸡胚与鼠胚系统在PC1-PC2空间高度平行，人MSC模型在更高阶主成分上呈现相似走向，表明这些模型适用于跨物种整合分析。
**CCN家族基因在软骨形成模型中的表达动态**
通过热图和线图分析bulk RNA-seq数据，研究人员发现CCN1和CCN2在所有模型中均为表达最高且持续上调的成员，鸡胚中CCN6缺失，鼠胚中六种CCN均有表达；人MSC模型中CCN5下调，CCN4和CCN6无稳定趋势。整体显示CCN1/2保守上调，CCN3-CCN6呈模型依赖性。
**软骨形成系统中的基因共表达网络**
应用WGCNA以培养天数作为性状，研究人员识别出与各CCN成员显著相关的共表达模块：鸡胚中CCN1/2位于青绿色模块，CCN3/4位于黄色模块，CCN5位于黄绿色模块；鼠胚中Ccn1位于洋红色模块，其余位于青绿色模块；人MSC中CCN1/2/3/5位于青绿色模块，CCN4位于黑色模块，CCN6位于紫色模块。这些模块为后续PPI网络构建提供了基础。
**CCN蛋白调控网络及核心枢纽基因**
通过将WGCNA模块分配与STRING数据库第一邻居PPI分析结合，研究人员构建了各物种的CCN蛋白调控网络（人122基因，鼠222基因，鸡33基因）。度中心性分析显示CCN1和CCN2在三个物种中均为连接度最高的枢纽节点。人和鼠共有高连接基因包括COL1A1、THBS1、SPP1、IGF1、IL6、EGFR、STAT3、CD44、TIMP1、HIF1A等，鸡网络节点较少且缺乏这些保守相互作用子。
**CCN网络跨物种的功能分类与富集**
通过GO和KEGG富集分析并归类为五大功能类别（细胞外基质、细胞命运、细胞骨架、微环境响应、信号网络），研究人员发现人和鼠的富集模式高度相似，以ECM组织、胶原生物合成、软骨组织形成、生长因子和骨化通路为主；鼠网络额外富含机械敏感的Hippo和PI3K-Akt信号；鸡网络仅富集TGF-β、SMAD信号及胶原/ECM类别，功能覆盖有限。
**哺乳动物CCN调控网络的保守性**
通过直系同源映射及Jaccard指数计算，研究人员发现整体保守性中等（Jaccard值约0.25-0.30）。生长因子和信号模块（IGF、EGFR、SMAD、Hippo）最为保守，微环境响应和细胞骨架类别保守性最低，ECM相关类别居中。人和鼠中心的保守指数表明人网络中的直系同源比例较高，鼠网络包含更多物种特异性扩展。
**通路特异性PPI网络与直系同源映射**
针对软骨细胞增殖、软骨组织形成、TGF-β信号、Hippo信号等关键通路，研究人员重建了节点着色区分直系同源对的PPI网络。在软骨细胞增殖网络中，CCN2和CCN4连接PTHLH和BMP/TGF-β输入到RUNX2、SMAD3、COL2A1等；TGF-β网络中CCN1位于保守SMAD-受体核心与鼠特异性组分之间；Hippo网络中CCN2嵌入保守LATS2-TAZ模块，鼠特异性激酶和Wnt配体提供额外控制。
**多功能枢纽基因：CCN调控网络的关键节点**
网络整合揭示了一小群直系同源基因（COL2A1、COL1A1、TGFBR1、SMAD3、SRC、HIF1A、IGF1、SPP1、CD44）参与多个功能类别，连接ECM、生长因子、血管生成、低氧和粘附模块，提示CCN网络通过协调这些枢纽发挥多效调控作用。
**禽类CCN网络的功能多样性有限**
鸡CCN调控网络仅有16个基因可映射至目标功能类别（ECM、分化、信号），远少于人的72个和鼠的139个。六种三方直系同源基因（DCN、PENK、SMAD3、SPARC、TGFB3、THBS1）在鸡模型中呈现较弱且短暂的诱导，SMAD3和THBS1早期达峰后下降，PENK下调，表明鸡模型仅捕获哺乳动物CCN网络的一个子集。
**人软骨形成中CCN介导调控的单细胞分辨率**
基于人iPSC来源软骨形成单细胞RNA-seq数据（GSE160787），研究人员对10,008个细胞进行聚类并注释为间充质、软骨细胞、神经外胚层等五大类。CCN1和CCN2为主表达转录本，CCN网络活性在间充质_1/2中最高，在D7-D14达峰，后随软骨细胞成熟下降。配体-受体分析显示CCN1(CYR61)-ITGB1为最强预测信号，间充质为主要信号发送者。
**体内组织发育中CCN介导调控的单细胞分辨率**
通过将人和鼠CCN网络直系同源交集得到同源CCN调控网络，研究人员在人和鼠胚胎肢体单细胞数据中评分其活性。人胚胎肢体中，CCN1/2和ITGB1在间充质和软骨细胞中高表达，同源网络活性在近端间充质和软骨祖细胞中高，持续至肥大和骨化阶段；鼠胚胎肢体中，Ccn1和Itgb1在间充质和生长板软骨细胞中主导，Ccn2表达和网络活性集中于Col1a1+间充质和生长板阶段。
总结讨论部分，研究人员指出CCN1/2是保守核心枢纽，连接TGF-β/SMAD、BMP、FGF及Hippo通路，协调ECM组装与生长因子和机械信号。物种特异性扩展主要体现在低氧和机械感知通路：人MSC模型更适于研究成年软骨相关低氧和炎症响应，鼠微团模型适于保守发育机制，鸡模型因功能覆盖有限需谨慎用于临床前评估。单细胞分析验证了CCN网络在间充质向软骨细胞转化阶段的活性峰值，体内数据表明从软骨祖细胞到骨化阶段持续活跃。研究结论翻译如下：总体而言，这一跨物种多尺度分析将CCN蛋白（特别是CCN1和CCN2）定位为保守软骨形成网络的核心组织者，同时描绘了环境感知、机械传导及特定信号分支如何在物种和模型之间多样化。该框架为选择合适软骨形成模型、在再生策略中确定CCN靶向干预时机以及利用CCN调控通路作为软骨修复和骨关节炎治疗的潜在切入点提供了机制指导。
