解码鸟嘌呤核苷酸结合蛋白γ亚基10（GNG10）在结直肠癌中的致癌角色：一种非经典Wnt通路驱动的机制

《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Decoding the Oncogenic Role of GNG10 in Colorectal Cancer: A Non-Canonical Wnt Pathway–Driven Mechanism

　　

鸟嘌呤核苷酸结合蛋白γ亚基10（Guanine nucleotide-binding protein subunit gamma-10, GNG10）参与多种生物学过程，但其在结直肠癌（Colorectal cancer, CRC）中的特定致癌作用仍不明确。本研究旨在阐明GNG10在CRC进展中的表达模式、生物学功能及其潜在机制。研究人员整合了癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据集、组织微阵列免疫组织化学及多变量Cox回归模型以评估GNG10的临床意义。通过体外和体内的功能获得与缺失模型，评估了GNG10对CRC恶性表型和肿瘤干性的功能影响。机制研究通过基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）、蛋白质印迹（Western blotting）以及采用药理学抑制（Box5）和基因敲低（shRHOA）的双重挽救策略来深入探究。研究发现GNG10在CRC组织中显著高表达，与晚期病理分期和不良总生存期相关。多变量分析表明GNG10的预后价值与肿瘤进展密切相关。功能上，GNG10敲低抑制了CRC细胞增殖、迁移和干性，同时促进凋亡。机制上，GNG10激活了非经典Wnt/RHOA/JNK/NFATc1信号轴。关键的是，调控GNG10不影响活性或总β-catenin水平，从而排除了经典Wnt通路的参与。Box5药理学抑制和RHOA基因敲除均能有效消除GNG10诱导的致癌表型及肿瘤干细胞标志物（CD44、CD133、OCT4、Nanog、SOX2）的上调。体内异种移植模型证实GNG10敲低抑制了肿瘤生长并降低了增殖和干性标志物的表达。本研究结果表明GNG10通过非经典Wnt信号通路促进CRC进展和干性，提示GNG10是CRC中一个有前景的预后指标和治疗靶点。

结直肠癌（Colorectal cancer, CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤及第二大癌症死亡原因，其发病率和死亡率呈持续上升趋势，约占全部癌症诊断的10%，对公共卫生系统造成重大负担。已知的CRC危险因素包括遗传性易感性（如APC和KRAS基因突变）以及肥胖、缺乏运动、高加工肉类低纤维饮食等生活方式因素。尽管手术、化疗、放疗及靶向治疗等手段不断进步，晚期或转移性CRC患者的临床预后仍不理想，现有治疗面临耐药性、毒副作用及生存获益有限等挑战。因此，深入解析驱动肿瘤进展的分子机制对于发现新型治疗靶点和优化临床方案至关重要。

GNG10基因位于9p13.3染色体位点，编码鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G protein）γ亚基家族的重要成员，在大脑、肝脏和造血系统等多种生理部位广泛分布。GNG10作为G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor, GPCR）转导网络的关键调控因子，参与调控cAMP/PKA和MAPK等内部信号级联，对细胞生长、分化和凋亡等细胞活动至关重要。近年研究表明GNG10在多种恶性肿瘤中具有促肿瘤作用：在胶质瘤中，GNG10可作为预测指标并通过PI3K-Akt信号轴调控肿瘤发展；在头颈部鳞状细胞癌（Head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）中，其异常表达与放射敏感性和临床结局相关；在CRC中，GNG10已被证实通过与长链非编码RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）CCAT1/miR-4679调控网络的相互作用促进肿瘤进展。然而，GNG10在CRC中的精确下游信号网络仍不明确。值得注意的是，GPCR信号与Wnt级联之间存在密切的功能串扰，Wnt受体特别是Frizzled（FZD）家族在结构上类似于GPCR，可在配体结合后直接激活异源三聚体G蛋白，而释放的Gβγ复合物（其中GNG10作为核心组分）主要通过β-catenin非依赖性的非经典Wnt途径（包括Wnt/平面细胞极性(Wnt/planar cell polarity, PCP)和Wnt/Ca²⁺信号流）传播信号。这些非经典轴 notorious for 通过RHOA和JNK等下游效应因子调控细胞骨架动力学、细胞迁移和肿瘤干性。基于这些理论联系，研究人员设计了本项研究，以阐明GNG10在CRC中的功能重要性及其作为临床靶点的可行性，为CRC的分子景观和精准治疗策略提供新视角。

该研究发表于《Journal of Cellular and Molecular Medicine》。研究人员采用整合性转化研究框架，开展了以下工作：首先，通过整合TCGA数据库的临床生物信息学与组织微阵列验证，确立GNG10作为CRC robust预后指标的地位；继而，通过多种体外实验和鼠异种移植研究，全面评估GNG10对肿瘤生长、恶性表型和肿瘤干性的影响；关键地，结合药理学抑制和遗传挽救策略，描绘了GNG10调控的精确下游信号级联。本研究样品来源于上海傲铎生物技术有限公司提供的CRC组织微阵列（#HColA180Su15-M-102），包含89例肿瘤组织和71例正常组织，并经南方医科大学珠江医院医学伦理委员会批准。

主要技术方法包括：基于TCGA数据库的生物信息学分析（含GSEA）；组织微阵列免疫组织化学染色及半定量评分；HCT116和RKO等CRC细胞系的体外功能实验（CCK-8、克隆形成、流式细胞术、划痕愈合、Transwell迁移、3D肿瘤球形成等）；使用Box5（Wnt5a拮抗剂）进行药理学抑制；shRNA介导的GNG10和RHOA基因稳定敲低及过表达；定量实时PCR和蛋白质印迹分析；以及NCG小鼠皮下异种移植瘤模型。

**GNG10在CRC中上调并与不良预后相关**

研究人员基于TCGA基因表达数据进行生物信息学分析，发现GNG10在肿瘤组织中相对于正常组织显著高表达。生存分析表明高GNG10表达与缩短的总生存期（Overall survival, OS）和无进展生存期（Progression-free survival, PFS）显著相关。为在蛋白水平验证这一发现，研究人员对89例肿瘤组织和71例正常组织来源的组织微阵列进行免疫组织化学染色，代表性图像显示GNG10在肿瘤组织中显著升高，量化评分证实GNG10在CRC样本中显著过表达。GNG10表达与临床病理特征的相关性分析表明，高GNG10表达与高级别肿瘤显著相关。多变量Cox比例风险回归分析构建了两个模型（模型A：调整GNG10、年龄、性别和总体AJCC分期；模型B：调整GNG10、年龄、性别、T分期、N分期和M分期），结果显示高龄和晚期肿瘤分期是显著的独立危险因素，但GNG10表达在任一模型中均未保持统计学显著性。这表明GNG10在单变量分析中的预后价值与肿瘤分期进展密切相关。组织微阵列队列的随访数据生存分析显示，GNG10高表达患者生存结局显著更差，与TCGA生物信息学分析一致。

**GNG10敲低抑制CRC细胞增殖、迁移并促进凋亡**

研究人员首先评估了GNG10在一组人CRC细胞系中的基础表达，发现HCT116和RKO细胞具有最高的内源性表达水平。设计两个独立shRNA敲低GNG10表达后，通过定量PCR和蛋白质印迹验证敲低效率显著。功能实验表明，GNG10敲低显著抑制CRC细胞生长，CCK-8增殖实验和克隆形成实验一致证实了这一点。流式细胞术分析显示GNG10敲低显著增加凋亡细胞比例。划痕愈合实验中，GNG10沉默的HCT116和RKO细胞在24小时孵育后划痕区域闭合显著延迟。Transwell迁移实验同样显示GNG10敲低导致迁移至下室的细胞数量显著减少。这些结果共同表明GNG10在促进CRC细胞恶性表型中发挥关键作用。

**GNG10通过非经典Wnt通路调控CRC进展**

为探究GNG10在CRC中的下游分子机制，研究人员基于TCGA数据进行GSEA分析，结果显示GNG10表达在"β-catenin非依赖性Wnt信号"通路中呈正富集，提示GNG10可能介导非经典Wnt信号。为验证这一假设，通过Western blotting检测了该通路关键组分的表达水平：在HCT116和RKO细胞中，GNG10敲低导致RHOA、JNK和NFATc1蛋白水平显著降低，而过表达则显著上调这些蛋白的表达。为严格排除经典Wnt级联的参与并确认通路特异性，研究人员进一步评估了β-catenin表达：GNG10敲低或过表达均未改变活性（非磷酸化）或总β-catenin水平，下游靶标c-Myc以严格的β-catenin非依赖性方式被GNG10上调，可能由前述非经典JNK级联驱动。这些数据确凿证明GNG10特异性激活CRC中的非经典Wnt信号轴。进一步的功能相关性评估中，使用Box5处理GNG10过表达细胞，发现Box5逆转了GNG10过表达诱导的RHOA、JNK和NFATc1上调，不仅抑制了非经典Wnt通路的激活，还显著减弱了GNG10过表达介导的细胞增殖增强和凋亡抑制。这些发现表明非经典Wnt通路是GNG10在CRC进展中的关键下游介导因子。

**GNG10通过Wnt通路调控CRC干性**

鉴于非经典Wnt信号与肿瘤干性的关联，研究人员进一步研究了GNG10是否调控CRC细胞的肿瘤干细胞（Cancer stem cell, CSC）样特性。蛋白质印迹分析显示，GNG10敲低后关键干性标志物CD44、CD133、OCT4、NANOG和SOX2的蛋白水平显著下调，非经典Wnt通路组分（JNK、NFATc1和RhoA）同样降低，进一步支持GNG10介导的信号与干性维持之间的关联。流式细胞术检测CD44⁺CD133⁺细胞比例（公认的肿瘤干细胞样细胞标志组合）显示，GNG10沉默导致该比例在两种细胞系中均显著降低。肿瘤球形成实验评估自我更新能力，发现GNG10敲低显著抑制了CRC细胞形成的肿瘤球数量和大小。这些数据共同表明GNG10参与维持CRC细胞干性，可能通过激活非经典Wnt信号通路实现。

**非经典Wnt通路介导GNG10诱导的CRC干性**

为确定非经典Wnt通路是否介导GNG10在CRC干性中的调控作用，研究人员首先进行药理学挽救实验：过表达GNG10后用Box5处理。蛋白质印迹分析显示，GNG10过表达诱导的干性相关标志物（CD44、CD133、Nanog、OCT4和SOX2）上调被Box5显著减弱。流式细胞术分析揭示GNG10过表达引起的CD44⁺CD133⁺细胞群体富集在Box5处理后显著逆转。肿瘤球形成实验评估自我更新功能影响，发现GNG10过表达显著增加肿瘤球大小和相对面积，但该效应被Box5介导的通路抑制有效抵消。

尽管药理学抑制强烈提示非经典Wnt通路的参与，但单一小分子抑制剂存在潜在脱靶效应风险。为确立因果关系，研究人员同时进行遗传挽救实验，靶向该级联的关键下游效应因子RHOA。蛋白质印迹证实GNG10成功过表达同时RHOA有效敲低。引人注目的是，RHOA基因敲除（shRHOA）完全模拟了Box5处理的效应：RHOA敲低显著消除了GNG10诱导的所有评估CSC标志物（CD44、CD133、Nanog、OCT4和SOX2）的上调，完全逆转了CD44⁺/CD133⁺亚群的扩增，并显著减弱了GNG10增强的肿瘤球形成和加速的增殖。药理学抑制和遗传调控的一致结果明确证明，非经典Wnt通路特别是RHOA介导的轴在介导GNG10诱导的CRC干性中发挥关键作用，进一步支持其参与肿瘤进展。

**GNG10敲低在体内抑制肿瘤生长和肿瘤干性**

为在体体验证GNG10在CRC进展中的作用，研究人员建立了NCG小鼠皮下异种移植模型。在肿瘤细胞接种后的多个时间点（第7、10、12、14和17天）测量肿瘤体积，结果显示来源于GNG10敲低（shGNG10）细胞的肿瘤生长显著低于对照组。实验终点肿瘤重量测量证实GNG10敲低显著抑制了肿瘤负荷。切除肿瘤图像直观展示了shGNG10组肿瘤大小的减小。免疫组织化学染色进一步确认shGNG10组中GNG10表达降低，验证了体内敲低效率；值得注意的是，细胞增殖标志物Ki67在GNG10敲低肿瘤中显著降低，与体外发现一致。此外，异种移植瘤组织的蛋白质印迹分析揭示GNG10敲低抑制了非经典Wnt通路关键蛋白（JNK）和肿瘤干性标志物（SOX2和CD44）的表达。这些发现为GNG10通过非经典Wnt信号通路促进CRC肿瘤生长和干性提供了强有力的证据，强化了其作为治疗靶点的潜力。

在讨论部分，研究人员系统回顾了GNG10的已知生物学功能。GNG10属于G蛋白γ亚基家族，与造血、血管重塑和组织再生等多种生理过程相关，在骨髓来源的红系祖细胞中显著上调，并作为特发性肺动脉高压（Idiopathic pulmonary arterial hypertension, IPAH）和肝再生中的枢纽基因，提示其为细胞分化和增殖能力的关键驱动因子。除生理过程外，GNG10与多种癌症相关：在黑色素瘤中被鉴定为频繁突变基因，在胶质瘤中通过PI3K-Akt通路作为预后因素，在鼻咽癌中与放疗反应和生存结局相关。本研究在此基础上提供了GNG10在CRC中作为癌基因的直接证据。

研究人员指出重要的临床局限性：尽管GNG10在单变量分析中与不良患者生存强烈相关，但在多变量Cox回归模型中调整总体AJCC和TNM分期等宏观参数后，GNG10未保持独立预后显著性，表明其预测能力与晚期病理进展密切相关。尽管如此，GNG10在晚期CRC中的显著上调仍强烈强调了其驱动肿瘤恶性的重要生物学作用。

Wnt信号作为调控发育和稳态的基本通路，在癌症发展中被频繁劫持。在CRC中，失调的Wnt活性促进肿瘤发生、进展和治疗抵抗。虽然经典Wnt/β-catenin通路的致癌作用已明确，但非经典通路作为同等重要的肿瘤行为调节因子逐渐显现，影响细胞增殖、迁移、侵袭和干性样特征。非经典Wnt信号通过RHOA、JNK和NFATc1而非β-catenin稳定化来驱动可塑性和疾病进展。

肿瘤干细胞的存在是恶性进展的关键特征，这类特殊细胞群具有强大的自我更新、治疗抵抗和增强的致瘤能力。Wnt信号特别是非经典Wnt通路是CSC维持的关键调节因子，Wnt通路激活通过上调核心转录因子（包括OCT4、SOX2和NANOG）驱动癌细胞的干细胞样特性，而阻断Wnt信号则通过耗竭CSC池限制肿瘤扩增。Wnt信号与代谢重编程的相互作用进一步增强CSC特性，促进肿瘤进展和转移。

本研究中，GNG10被鉴定为CRC进展中的致癌基因，并与非经典Wnt通路存在功能关联。生物信息学分析和体外实验表明GNG10过表达激活RHOA、JNK和NFATc1信号。关键地，通过证明GNG10调控不改变活性或总β-catenin蛋白水平，严格排除了经典Wnt/β-catenin级联在GNG10介导的致癌作用中的参与。进一步功能实验证实GNG10过表达促进CRC细胞增殖、迁移和干性，而其敲低抑制这些恶性表型。重要的是，虽然Box5药理学抑制逆转了GNG10的致癌效应，但研究人员通过遗传调控进一步确立了明确的因果关系：靶向下游效应因子RHOA的基因敲除完全模拟了Box5的效应，显著消除了GNG10诱导的肿瘤干性和增殖优势。这种双重验证提供了强有力的证据，表明GNG10特异性通过RHOA依赖的非经典Wnt信号调控CRC进展。

体内结果验证了GNG10敲低显著抑制肿瘤生长、降低CSC标志物（CD44和CD133）并抑制Wnt相关下游效应因子（JNK和SOX2）的激活。研究人员承认存在一定局限性：除上述独立预后价值的丧失外，虽然通过药理学（Box5）和遗传学（shRHOA）挽救方法牢固确立了非经典Wnt通路的下游参与，但直接上游机制联系——特别是GNG10如何物理性与Wnt受体或上游介质相互作用以启动该级联——仍有待阐明。

研究结论：本研究提供了令人信服的证据，表明GNG10通过激活非经典Wnt通路和增强癌细胞干性在CRC中发挥致癌基因功能。鉴于Wnt信号在 therapy抵抗和肿瘤复发中的既定作用，抑制GNG10或其相关通路可能为CRC提供新的治疗策略。进一步研究GNG10、Wnt信号和CSC调控之间的分子相互作用对于理解其作为CRC及其他恶性肿瘤治疗靶点的潜力至关重要。