《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：AFP Stimulates Glucose Metabolic Reprogramming Contributing to Hepatocellular Carcinoma Resist Sorafenib Through Activating PI3K/AKT Signalling Pathway
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甲胎蛋白（AFP）调节与肝细胞癌（HCC）耐药性相关的葡萄糖代谢重编程（GMR），但具体机制尚不清楚。本研究探讨了AFP调控GMR对HCC细胞索拉非尼耐受性的影响。研究人员收集了30例临床肝癌样本并利用多组学数据库；采用免疫组织化学（IHC）或蛋白质印迹法检测
甲胎蛋白（AFP）调节与肝细胞癌（HCC）耐药性相关的葡萄糖代谢重编程（GMR），但具体机制尚不清楚。本研究探讨了AFP调控GMR对HCC细胞索拉非尼耐受性的影响。研究人员收集了30例临床肝癌样本并利用多组学数据库；采用免疫组织化学（IHC）或蛋白质印迹法检测AFP、GMR相关蛋白、丙酮酸激酶M2（PKM2）及PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。通过MTT、克隆形成实验、流式细胞术和TUNEL评估AFP对HCC细胞索拉非尼耐药性的影响。测量了葡萄糖消耗、乳酸脱氢酶活性及ATP生成的变化。开展免疫共沉淀和免疫荧光实验以确定AFP与PKM2的相互作用。使用体内小鼠肿瘤模型研究肿瘤发生和发展的恢复情况。结果表明，AFP抑制了索拉非尼诱导的HCC细胞凋亡。AFP激活PI3K/AKT信号通路，促进GMR相关蛋白表达和酶活性。值得注意的是，AFP与PKM2的相互作用刺激了PKM2的活性以增强GMR，从而促进HCC对索拉非尼的耐药性。体内实验表明，抑制AFP表达可减弱肿瘤发生和生长，而PKM2过表达可恢复这种效应；PKM2在AFP介导HCC的GMR中发挥了关键的激活作用。总之，AFP激活PI3K/AKT信号通路，增强HCC细胞的有氧糖酵解，导致HCC对索拉非尼耐药。抑制AFP表达并靶向PKM2可能成为临床上逆转HCC患者索拉非尼耐受的新策略。
**论文解读：AFP通过PI3K/AKT信号通路调控葡萄糖代谢重编程促进肝细胞癌索拉非尼耐药性的分子机制**
**研究背景与问题**
肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌的主要类型（占75%–85%），具有高转移性和高死亡率。晚期HCC的治疗选择包括局部消融、放疗、化疗和分子靶向治疗。索拉非尼（Sorafenib）是一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂，于2005年获美国FDA批准用于晚期HCC治疗，可延长患者总生存期，但患者在治疗6个月内易产生耐药性。耐药机制复杂，涉及表皮生长因子受体（EGFR）、c-Jun、Akt通路激活以及癌症干细胞和上皮-间充质转化（EMT）增强。甲胎蛋白（AFP）作为HCC的重要肿瘤标志物，具有促进细胞增殖、迁移、免疫逃逸和抑制凋亡等生物学功能，且与肿瘤多药耐药密切相关。然而，AFP是否参与索拉非尼耐药尚不清楚。此外，癌细胞能量代谢改变（即Warburg效应）是肿瘤特征之一，丙酮酸激酶M2（PKM2）作为糖酵解关键限速酶，调控葡萄糖代谢重编程（GMR），在HCC中高表达并与耐药相关。本研究旨在阐明AFP作为关键因子在HCC中的作用，探讨其通过PKM2介导GMR影响索拉非尼耐药的分子机制。
**研究内容与结论**
研究人员通过临床样本、细胞实验和体内模型，发现AFP在HCC组织中显著高表达，并促进HCC细胞对索拉非尼的耐药性。AFP通过激活PI3K/AKT信号通路，上调GMR相关蛋白（HK2、GLUT1、LDHA、PKM2）的表达和酶活性，增强有氧糖酵解（葡萄糖消耗、LDH活性、ATP产生）。特别地，AFP与PKM2存在直接相互作用并共定位于细胞质，刺激PKM2活性，从而促进GMR。体内实验证实，抑制AFP表达可减弱肿瘤发生和生长，而PKM2过表达可恢复该效应。该研究首次揭示AFP-PKM2轴在索拉非尼耐药中的关键作用，为临床逆转HCC索拉非尼耐受提供了新靶点。论文发表在《Journal of Cellular and Molecular Medicine》。
**主要技术方法**
研究使用了以下关键技术方法：（1）临床样本队列：收集30例HCC患者手术切除的癌及癌旁组织，来源于海南医科大学第二附属医院（2019–2022年）；（2）生物信息学分析：利用TIMER和GEPIA数据库分析AFP mRNA表达差异；（3）慢病毒转染构建AFP过表达（HLE-AFP）和干扰（Bel7402-shAFP）细胞系；（4）免疫组化（IHC）和蛋白质印迹（Western blotting）检测蛋白表达；（5）MTT、克隆形成、划痕、Transwell实验评估增殖和迁移；（6）流式细胞术和TUNEL检测凋亡；（7）生化试剂盒测定葡萄糖消耗、LDH活性和ATP生成；（8）细胞外酸化率（ECAR）检测糖酵解速率；（9）免疫共沉淀（Co-IP）和免疫荧光分析AFP-PKM2相互作用；（10）裸鼠皮下异种移植模型评估体内肿瘤发生和生长。
**研究结果**
**3.1 AFP在人类肝癌组织中显著上调，是HCC的潜在生物标志物**
通过IHC、Western blotting和免疫荧光检测30对HCC组织微阵列，发现AFP在癌组织中表达显著高于癌旁组织。TIMER和GEPIA数据库进一步验证了该结果。
**3.2 AFP介导HCC细胞对索拉非尼的耐药性**
在AFP阴性HLE细胞中过表达AFP，增强了细胞增殖能力并拮抗索拉非尼的细胞毒性；在AFP高表达Bel7402细胞中干扰AFP表达，则减弱增殖能力并增加索拉非尼敏感性。划痕和Transwell实验显示AFP促进迁移并拮抗索拉非尼的抑制作用。TUNEL和流式细胞术表明AFP过表达拮抗索拉非尼诱导的凋亡，而干扰AFP则增强凋亡。Western blotting显示AFP上调耐药相关蛋白P-gp、下调促凋亡蛋白Bim。
**3.3 AFP刺激HCC细胞的葡萄糖代谢重编程（GMR）**
蛋白质组学KEGG分析显示AFP与GMR相关基因显著富集。AFP过表达增加葡萄糖消耗、LDH活性和ATP产生，干扰AFP则降低这些指标。Western blotting证实AFP上调GMR相关蛋白（HK2、GLUT1、LDHA、PKM2）。糖酵解抑制剂2-DG可抑制AFP刺激的葡萄糖消耗和LDH活性。ECAR实验显示AFP增强细胞外酸化速率。PI3K抑制剂LY294002可消除AFP对p-PI3K、p-AKT及GMR蛋白的上调作用，表明AFP通过激活PI3K/AKT信号通路促进GMR。
**3.4 AFP通过刺激PKM2表达和活性促进HCC细胞对索拉非尼耐药**
IHC和GEPIA数据库显示AFP与PKM2表达呈正相关。免疫荧光和Co-IP证实AFP与PKM2在细胞质共定位和直接相互作用。计算机模拟和氨基酸对接分析提示二者存在氨基酸相互作用。在HLE-AFP细胞中敲低PKM2可降低葡萄糖消耗和LDH活性；在Bel7402-shAFP细胞中过表达PKM2可恢复因AFP抑制而降低的糖代谢指标。MTT、克隆形成、划痕和Transwell实验显示，敲低PKM2可逆转AFP促进的增殖和迁移，增强索拉非尼敏感性；过表达PKM2则减弱AFP抑制效应。TUNEL和流式细胞术表明，敲低PKM2可降低AFP过表达细胞的存活率并升高凋亡率，过表达PKM2则逆转该趋势。Western blotting显示PKM2调控P-gp和Bim表达。
**3.5 体内实验：干扰AFP表达可减少HCC肿瘤发生和生长，PKM2过表达可恢复**
裸鼠皮下移植瘤模型显示，Bel7402-shAFP组肿瘤体积和重量显著小于对照，而(Bel7402-shAFP)-OE-PKM2组肿瘤生长恢复。Western blotting和IHC检测肿瘤组织发现，PKM2过表达恢复了因AFP抑制而降低的GMR相关蛋白（HK2、GLUT1、PKM2、LDHA）。
**总结讨论与结论**
讨论部分指出，AFP作为HSA家族成员，通过激活PI3K/AKT信号通路促进GMR相关蛋白表达，增强有氧糖酵解，导致HCC对索拉非尼耐药。AFP与PKM2的相互作用及其在细胞质中的共定位提示AFP可能直接调控PKM2活性。体内外实验一致证实了AFP-PKM2轴的关键作用。研究结论（翻译原文Conclusions）：本研究发现AFP是促进HCC对索拉非尼耐药的关键因子，并确定AFP是调控GMR的关键分子，AFP-PKM2轴在HCC索拉非尼耐药中发挥重要作用。本研究揭示了AFP通过激活PI3K/AKT信号通路促进PKM2表达、刺激PKM2活性、加速GMR进展，从而促进HCC细胞对索拉非尼耐受的分子机制。PKM2被鉴定为与AFP相互作用的重要下游靶点。该研究为克服肝癌耐药领域提供了理论突破，并为阐明HCC的GMR调控机制、靶向AFP进行肝癌精准临床治疗提供了新视角。
