冬凌草甲素治疗肝细胞癌的机制：网络药理学与实验验证

《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Elucidating the Mechanism of Oridonin in Treating Hepatocellular Carcinoma: Network Pharmacology and Experimental Validation

　　

冬凌草甲素（Oridonin）是一种来源于冬凌草（Rabdosia rubescens）的生物活性二萜类化合物，具有显著的抗肿瘤活性。尽管既往研究显示冬凌草甲素具有抗肝癌潜力，但其治疗肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）的分子机制仍需进一步探究。本研究利用网络药理学、分子对接和分子动力学模拟（MDS）阐明冬凌草甲素发挥HCC治疗作用的机制，并通过体外实验验证研究结果。首先，通过在线数据库检索确定冬凌草甲素治疗HCC的潜在靶点。随后，通过整合蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析、GO和KEGG富集分析阐明冬凌草甲素抗HCC的机制。最后，通过分子对接、MDS及体外实验证实上述发现。共鉴定出273个交集靶点。随后进行PPI网络分析，筛选出10个核心靶点。对核心靶点与冬凌草甲素进行分子对接研究，提示PIK3R1、EGFR、AKT1和JAK2可能是关键靶点。进一步的MDS显示冬凌草甲素与这些关键靶点之间存在强相互作用。后续的体外实验揭示，冬凌草甲素显著影响HCC细胞周期并诱导细胞凋亡。此外，冬凌草甲素显著抑制EGFR/PI3K/AKT信号通路内关键靶点的表达。这些发现表明，冬凌草甲素可能通过EGFR/PI3K/AKT信号通路发挥抗癌作用，为其在HCC治疗中的临床应用和机制研究提供了坚实的理论基础。

**论文解读：冬凌草甲素治疗肝细胞癌的机制——网络药理学与实验验证**

**研究背景与问题**
肝细胞癌（HCC）是全球第六大常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大原因，占原发性肝癌病例的80%以上，构成重大公共卫生问题。当前HCC的主要治疗手段包括手术切除、肝移植、消融、经动脉化疗栓塞（TACE）和药物治疗。然而，这些方法存在疗效有限、预后不佳、副作用显著及费用高昂等问题。晚期HCC患者常伴有肝功能恶化，限制TACE的多次应用；同时，HCC对化疗具有内在耐药性，导致抗肿瘤效果降低、总生存期改善微弱且毒性明显。因此，寻求靶向性强、副作用低的新疗法成为HCC研究的热点。传统中药（TCM）因其安全性、有效性、低毒性和适中价格在肿瘤治疗中受到广泛认可，其中冬凌草甲素（Oridonin）作为冬凌草中提取的生物活性二萜类化合物，具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗脓毒症、神经保护和免疫调节等多种药理作用，其抗癌活性已在胃癌、结直肠癌、食管癌、乳腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中得到证实。然而，冬凌草甲素抗HCC的具体分子机制尚未充分阐明，需要进一步系统研究。

**研究内容与结论**
研究人员采用网络药理学、分子对接和分子动力学模拟（MDS）等生物信息学工具，结合体外实验验证，系统揭示了冬凌草甲素治疗HCC的潜在机制。通过数据库检索和差异表达分析，共鉴定出273个冬凌草甲素与HCC的共同靶点；经PPI网络分析筛选出10个核心靶点（SRC、EGFR、PTPN11、AKT1、JAK2、PIK3R1、IGF1R、TP53、BCL2、CASP3）。分子对接显示冬凌草甲素与PIK3R1、EGFR、AKT1和JAK2具有高结合亲和力（结合能≤-8.4 kcal/mol）；MDS进一步证实复合物在100 ns模拟中保持稳定（RMSD约0.3 nm，RMSF低水平，氢键数量充足，Rg值低）。KEGG富集分析表明PI3K-AKT信号通路显著富集。体外实验显示，冬凌草甲素以剂量依赖性方式抑制HCC细胞（HepG2和Huh7）活力，诱导细胞周期阻滞于G₂期并促进凋亡。qRT-PCR和Western blotting验证了冬凌草甲素显著下调PIK3R1、AKT1、EGFR的mRNA和蛋白表达水平，免疫荧光实验进一步显示冬凌草甲素抑制AKT蛋白磷酸化（p-AKT）。结论：冬凌草甲素可能通过抑制EGFR/PI3K/AKT信号通路发挥抗HCC作用，为该药的临床应用和机制研究提供了理论依据。该论文发表于《Journal of Cellular and Molecular Medicine》。

**关键技术方法（不超过250字）**
（1）网络药理学：通过PharmMapper和Herb数据库获取冬凌草甲素潜在靶点；从GEO数据库（GSE29721、GSE45267、GSE112790）获取HCC基因表达谱，使用limma包和RobustRankAggreg进行差异分析；结合DrugBank、TTD、OMIM、GeneCards数据库获得HCC疾病靶点，取交集。
（2）分子对接：使用AutoDock Vina将冬凌草甲素与核心靶点（PIK3R1、AKT1、JAK2、EGFR等）进行对接，评估结合能。
（3）分子动力学模拟（MDS）：采用Desmond/Maestro软件，在TIP3P水模型和0.15 M NaCl溶液条件下进行100 ns模拟，分析RMSD、RMSF、氢键、Rg和自由能景观。
（4）体外实验：采用HepG2（低转移、野生型TP53）和Huh7（高转移、TP53突变Y220C）两种HCC细胞系（均经STR鉴定，来源为中国科学院上海细胞库），通过CCK-8检测细胞活力、流式细胞术检测细胞周期和凋亡、qRT-PCR和Western blotting检测EGFR/PI3K/AKT通路mRNA和蛋白表达，免疫荧光检测p-AKT水平。

**研究结果**

**3.1 冬凌草甲素潜在靶点分析**：通过PharmMapper和Herb数据库共鉴定出315个潜在靶点。

**3.2 HCC靶点预测**：从GEO三个数据集（GSE29721、GSE45267、GSE112790）中经RRA整合得到207个差异基因（84个上调，123个下调）；疾病数据库共获得11,318个HCC相关靶点。

**3.3 富集分析**：冬凌草甲素与HCC交集靶点273个。Cytohubba筛选出10个核心靶点（SRC、EGFR、PTPN11、AKT1、JAK2、PIK3R1、IGF1R、TP53、BCL2、CASP3）。GO分析涉及生物过程（细胞对化学应激、细胞内受体信号通路、细胞对活性氧反应等）、细胞组分（膜筏、膜微结构、囊泡腔等）和分子功能（核受体活性、配体激活转录因子活性等）。KEGG显示PI3K-AKT信号通路显著富集。

**3.4 分子对接**：冬凌草甲素与PIK3R1、AKT1、JAK2、EGFR等核心靶点的结合能均低于-7 kcal/mol（如PIK3R1：-9.2 kcal/mol，AKT1：-9.2 kcal/mol，JAK2：-8.9 kcal/mol，EGFR：-8.4 kcal/mol），表明强结合亲和力。

**3.5 分子动力学模拟**：
- **RMSD**：复合物在最初几纳秒波动后在0.3 nm附近稳定。
- **RMSF**：复合物RMSF值持续较低，表明蛋白-配体相互作用稳定。
- **氢键**：冬凌草甲素-JAK2复合物在100 ns内形成最多氢键（超过15个）；冬凌草甲素-PIK3R1和冬凌草甲素-EGFR复合物均超过10个；冬凌草甲素-AKT1复合物维持在3-6个。
- **Rg**：各复合物Rg值在特定范围内波动（例如冬凌草甲素-PIK3R1：1.78-1.82 nm），表明结构紧凑。
- **自由能景观**：深蓝色区域对应能量最低的稳定构象，例如PIK3R1-冬凌草甲素在Rg=1.785-1.81 nm、RMSD=0.25-0.3 nm时稳定，形成多个氢键和Pi-Alkyl相互作用。

**3.6 细胞活力检测**：CCK-8显示，冬凌草甲素对HepG2细胞在0-20 μM时影响小，40 μM时24 h存活率约89%；对Huh7细胞在10 μM和20 μM时平均存活率分别为60%和5.9%。后续选用Huh7细胞1 μM和7.5 μM，HepG2细胞20 μM和40 μM进行验证。

**3.7 冬凌草甲素对HCC细胞周期和凋亡的影响**：流式细胞术显示，与对照组相比，冬凌草甲素显著增加HCC细胞早期和晚期凋亡（p<0.05）；细胞周期评估表明G1期和S期细胞比例减少，G₂期细胞显著增加（p<0.05），提示冬凌草甲素将HCC细胞阻滞于G₂期并诱导凋亡。

**3.8 冬凌草甲素抑制PIK3R1、AKT1和EGFR的mRNA表达**：qRT-PCR显示，冬凌草甲素以剂量依赖性方式显著下调PIK3R1、AKT1和EGFR的mRNA表达水平。

**3.9 冬凌草甲素抑制EGFR/PI3K/AKT信号通路蛋白表达**：Western blotting显示，与对照组相比，冬凌草甲素处理组PI3K、AKT和EGFR蛋白表达水平显著降低（p<0.05）；免疫荧光显示p-AKT蛋白水平显著下降（p<0.05），表明冬凌草甲素抑制EGFR/PI3K/AKT信号通路激活。

**讨论与结论**
讨论部分指出，尽管HCC诊疗取得进展，但预后差和复发率高的问题仍然存在。冬凌草甲素通过整合网络药理学、分子对接、MDS和体外实验，系统揭示了其抗HCC机制。273个潜在靶点中，前10个核心靶点包括PIK3R1、AKT1、JAK2、EGFR等。PIK3R1编码PI3K调节亚基，其低表达可导致HCC细胞生长抑制和G₂/M期阻滞；AKT是信号通路核心节点，在癌症中常过度激活；EGFR激活后通过自磷酸化招募含SH2结构域蛋白（如PI3K）启动下游信号。GO分析提示冬凌草甲素可能通过靶向细胞内受体信号通路、调节凋亡信号通路及核受体/蛋白酪氨酸激酶活性发挥作用。KEGG富集显示PI3K-AKT信号通路与细胞凋亡通路受影响。分子对接和MDS证实冬凌草甲素与核心靶点稳定结合。体外实验表明，冬凌草甲素通过抑制EGFR/PI3K/AKT通路蛋白磷酸化，阻滞细胞周期并促进凋亡。研究局限性在于仅选择了EGFR/PI3K/AKT信号通路且进行了体外实验，需动物实验进一步验证；未来将探索其他作用机制。

**研究结论翻译**：本研究采用网络药理学、分子对接、分子动力学模拟与体外实验验证相结合的综合方法，这些发现为冬凌草甲素通过EGFR/PI3K/AKT信号通路发挥抗肝细胞癌作用提供了支持性证据。