大鼠和小鼠缰核复合体中μ-阿片受体mRNA与蛋白的定位

《Journal of Comparative Neurology》：Mu Opioid Receptor mRNA and Protein Localization Across the Rat and Mouse Habenula

　　

缰核(Hb)具有高强度μ-阿片结合位点及受体(MOR)表达。它包含内侧和外侧亚区（分别为MHb和LHb），然而MOR在这两个区域分布的细节仍存在争议。MHb和LHb参与几乎不重叠的神经环路；因此，准确解析MOR在它们之间的表达对于理解MOR配体如何影响行为至关重要。本研究利用原位杂交(ISH)和免疫细胞化学(ICC)系统绘制了缰核复合体中Oprm1 mRNA和MOR蛋白的分布图。研究人员在大鼠和小鼠组织中展开研究，以评估两种常见实验物种的表达差异，并在Oprm1-Venus/Venus小鼠中进行平行定位。重要的是，研究人员在两种物种的MHb和LHb中均发现了mRNA和蛋白。在大鼠中，MHb和LHb分别有39±3%和21±4%的细胞表达Oprm1。这些比例在小鼠中更高：MHb为57±1%，LHb为32±4%。在大鼠和小鼠中，MHb中Oprm1斑点/阳性细胞均多于LHb（p<0.0001）。最高强度的标记定位于所有方法中MHb的外侧缘。ICC显示MOR定位于两个区域的纤维和胞体。在LHb中，MOR标记沿前后(AP)轴在中间切片中最密集。在大鼠中，研究人员还观察到在AP轴中间水平背侧LHb以及更后方的内侧LHb有更强的标记。这些结果表明，MHb和LHb都可以通过各自环路参与MOR介导的效应。

论文解读：大鼠和小鼠缰核复合体中μ-阿片受体mRNA与蛋白的定位

研究背景与立项依据

缰核(Habenula, Hb)是丘脑上区一对进化保守的小核团，分为内侧缰核(Medial Habenula, MHb)和外侧缰核(Lateral Habenula, LHb)。Hb以高表达μ-阿片受体(Mu Opioid Receptor, MOR)著称。MHb主要投射至脚间核(Interpeduncular Nucleus, IPN)，参与厌恶与应激处理；LHb接收多脑区输入并投射至中脑多巴胺及五羟色胺系统，编码负性奖赏预测误差。尽管MHb与LHb的环路几乎不重叠，但MOR在两者中的精细分布长期存在争议，既往研究多强调MHb的高表达，而LHb的功能性MOR证据常被忽视。明确MOR在亚区的定位是理解阿片类药物如何调控情绪与动机行为的基础。

本研究由Elyssa B. Margolis等团队完成，发表于《Journal of Comparative Neurology》。

主要技术方法概览

研究人员以成年雄性及雌性Sprague–Dawley大鼠、C57Bl6/J小鼠以及Oprm1-^Venus/Venus敲入小鼠为样本队列。组织经灌注固定、切片后，采用RNAscope原位杂交(ISH)检测Oprm1 mRNA，以Tac2/Tac3作为MHb边界参照；并行免疫细胞化学(ICC)使用抗MOR C端多克隆抗体及抗-NeuN抗体定位蛋白；Oprm1-^Venus/Venus组织以抗-GFP放大内源荧光。图像经Big Warp配准、QuPath及Fiji分析，统计Oprm1+细胞比例、每细胞斑点(puncta)数及ICC强度热图，并进行混合效应模型与多重比较检验。

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研究结果

3.1 大鼠Hb中Oprm1分布

通过RNAscope，研究人员发现Oprm1+细胞主要聚集于MHb外侧缘，在AP轴中间水平(-3.0 mm后囟)最显著；LHb散布中等强度信号，后囟-3.5 mm处背外侧LHb及-4.0 mm处内侧LHb可见较强细胞。定量上，MHb有39±3%细胞为Oprm1+，LHb为21±4%（p<0.0001）；MHb每阳性细胞平均11±2斑点，LHb为4±1（p<0.0001）。AP分析显示-3.0 mm水平阳性率与斑点数最高。

3.2 小鼠Hb中Oprm1分布

在C57Bl6/J小鼠中，MHb外侧缘高信号贯穿全AP轴，范围较宽；LHb在-1.5与-1.8 mm后囟的中间水平有较高Oprm1+细胞，尤其靠近MHb边界的背侧与内侧LHb。定量：MHb 57±1%阳性，LHb 32±4%（p<0.0001）；每细胞斑点数为15±1（MHb）vs 5±1（LHb）（p<0.0001）。小鼠整体Oprm1表达高于大鼠，尤其MHb。

3.3 大鼠Hb中MOR蛋白分布

ICC显示MOR在MHb沿外侧缘呈胞体与纤维混合标记，从中间AP水平向背侧后移。LHb在中间(-3.3 mm)及部分后位最密，背外侧LHb可见胞体轮廓，内侧LHb以纤维为主；后位(-3.6、-4.0 mm)内侧LHb标记更明显。跨动物配准热图确认MHb外侧窄带及LHb中间-内侧高密度。

3.4 小鼠Hb中MOR蛋白分布

小鼠MHb外侧缘强MOR标记贯穿全AP轴，多环绕胞体。LHb在前(-1.2 mm)以腹内侧纤维为主；-1.5 mm见背外侧LHb纤维与少量胞体；-1.8 mm中间水平内侧半最密；后位信号稀疏。热图汇总显示LHb中间水平内侧偏高，且小鼠可见纹状体髓质(stria medullaris, sm)纤维标记。

3.5 Oprm1-^Venus/Venus小鼠中MOR-Venus分布

用抗-GFP放大内源Venus信号，研究人员发现MHb背外侧与外侧强标计，内侧三分之一弱；LHb各AP均有信号，中间(-1.8 mm)最广且以内侧LHb为中心，含胞体与纤维；后位信号低但沿MHb边界及后屈束(fasciculus retroflexus, fr)仍可见。跨动物平均显示LHb内侧边缘及fr、sm纤维持续表达，与野生型ICC略有差异。

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讨论总结与结论翻译

研究人员指出，Oprm1 mRNA与MOR蛋白在MHb和LHb均存在，MHb比例与每细胞转录本更高，且外侧缘最强；LHb在中间AP水平及部分后位内侧/背外侧也有功能性MOR。物种间小鼠整体表达更强，LHb分布模式略有不同。技术层面，RNAscope以≥2 puncta定义阳性，ICC抗C端可能低估胞外/远距树突蛋白；Oprm1-^Venus/Venus与ICC总体重叠但显示更广MHb及fr纤维。

基因到环路层面，Oprm1多种剪接变体可能分区分布，MHb高MOR区投射IPN，与终端易化谷氨酸释放吻合；LHb内侧接受外侧视前区(LPO)输入，对MOR敏感，对应内侧LHb较高MOR标记。单细胞转录组关联显示Oprm1+细胞常共标GPR151、Calb2、Cck（MHb）或Lapr1、Htr2c（LHb），提示特定环路调制潜力。

结论部分原文翻译：

综上，本研究定位了大鼠和小鼠MHb与LHb中的Oprm1 mRNA和MOR蛋白。这补充了两个区域均具功能性MOR的离体生理证据。由于MHb和LHb的输入输出连接基本不重叠，这两大MOR调控脑区的功能应被视为独立。结合MOR激活的解剖分布、生理影响及基于环路的行為研究，将增进对MOR如何参与情绪与行为调控的理解。