《Journal of Comparative Neurology》：Proline-Rich Transmembrane Protein 2 Is Variably Expressed Across Excitatory and Inhibitory Neurons in Mouse Motor Circuits
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富含脯氨酸的跨膜蛋白2（PRRT2）在自主运动控制中发挥关键作用，其功能缺失性突变可导致阵发性运动诱发性运动障碍（PKD）。尽管小脑被认为是PKD的责任脑区，但近期研究表明PRRT2亦调控纹状体多巴胺能活性，提示其功能不仅限于小脑，还涉及基底神经节运动环路。然
富含脯氨酸的跨膜蛋白2（PRRT2）在自主运动控制中发挥关键作用，其功能缺失性突变可导致阵发性运动诱发性运动障碍（PKD）。尽管小脑被认为是PKD的责任脑区，但近期研究表明PRRT2亦调控纹状体多巴胺能活性，提示其功能不仅限于小脑，还涉及基底神经节运动环路。然而，表达PRRT2的神经元细胞类型与运动功能之间的关系尚不清楚。本研究中，研究人员通过小鼠中脑原代神经元及脑切片的免疫荧光染色，确定了PRRT2阳性神经元的神经化学类型。PRRT2主要表达于谷氨酸能神经元和γ-氨基丁酸（GABA）能神经元，而非多巴胺能或胆碱能神经元。研究发现，PRRT2优先表达于Vglut1阳性而非Vglut2阳性的皮层投射神经元和小脑颗粒细胞，以及基底神经节的GABA能中等多棘神经元，并在轴突束及突触前末梢或其附近区域定位。综上所述，PRRT2在运动相关神经环路的兴奋性和抑制性神经元中存在差异性表达，可能在神经元兴奋性和自主运动调控中发挥更为多样的作用。
富含脯氨酸的跨膜蛋白2（PRRT2）是调控自主运动的关键分子，其功能丧失可导致阵发性运动诱发性运动障碍（paroxysmal kinesigenic dyskinesia, PKD）。尽管PRRT2在小脑的功能异常被认为是PKD的主要病因，但Hatta等人的前期研究发现，携带PKD相关PRRT2突变基因敲入（knock-in, KI）小鼠表现出多巴胺相关的运动缺陷，且纹状体多巴胺释放过度，提示PRRT2可能同时作用于皮层-基底神经节-丘脑和皮层-脑桥-小脑-丘脑这两条主要运动环路。然而，究竟哪些神经元类型表达PRRT2，及其与运动功能的确切关系尚不明确。因此，深入表征PRRT2阳性神经元的细胞类型对于理解PRRT2与运动调控的关系至关重要。
该研究由Hatta、Watanabe等人完成，并于《Journal of Comparative Neurology》发表。研究人员采用野生型及PRRT2 KI小鼠（C57BL/6J背景）作为实验样本，通过免疫荧光染色结合定量共定位分析，系统解析了PRRT2在运动相关脑区的表达模式及其细胞类型特异性。
研究采用的关键技术方法包括：小鼠中脑原代神经元培养及脑切片制备；荧光免疫细胞化学（immunocytochemistry）和免疫组织化学（immunohistochemistry）染色；借助共聚焦显微镜及数字切片扫描仪获取高分辨率图像；运用ImageJ Fiji软件及其JACoP插件进行基于对象和基于像素的共定位定量分析，计算Manders'相关系数（MCC）和Pearson相关系数（PCC）；采用Student's t检验、单因素及双因素方差分析（ANOVA）进行统计学比较。
**PRRT2在中脑原代神经元中的表达特征**
研究人员首先通过中脑原代神经元培养体系，分析了PRRT2在体外的表达模式。通过将PRRT2与多种神经化学标志物进行免疫荧光双标或三标，发现PRRT2定位于神经元胞体膜和神经突起，但不与酪氨酸羟化酶（Th）和多巴胺转运体（Dat）阳性的多巴胺能神经元共定位。与之相反，Prrt2与谷氨酸脱羧酶65（Gad65）、谷氨酸脱羧酶67（Gad67）等GABA能标志物，以及囊泡谷氨酸转运体1（Vglut1）、Vglut2和囊泡GABA转运体（Vgat）等突触前标志物存在部分共定位。定量分析显示，PRRT2在谷氨酸能和GABA能神经元中的表达显著高于多巴胺能神经元。值得注意的是，PRRT2与突触前标志物的共定位比例有限，提示其可能广泛分布于胞体膜、轴突及突触旁区域，而非局限于突触前末梢。
**PRRT2在不同类型神经元中的区域特异性表达**
通过全脑切片免疫荧光染色，研究人员发现PRRT2在小脑中分子层、黑质网状部（substantia nigra pars reticulata, SNr）和丘脑等区域富集，在皮层、脑桥核、纹状体和外侧苍白球（external globus pallidus, GPe）等部位表达丰富，而在黑质致密部（substantia nigra pars compacta, SNc）和小脑颗粒层表达低至中等水平，在底丘脑核（subthalamic nucleus, STN）、小脑浦肯野细胞层和小脑核中表达极低。与Vglut1、Vglut2、Vgat、Darpp-32（多巴胺-和cAMP-调节磷蛋白，Mr 32 kDa，作为纹状体中等多棘神经元的标志物）及Dat等标志物的全脑比对显示，PRRT2的表达模式呈现明显的神经化学类型和区域依赖性：在皮层、丘脑等接收皮层投射的区域呈现Vglut1样表达模式，而在基底神经节则呈现Vgat和Darpp-32样表达模式。
**PRRT2在皮层投射神经元终末区及小脑颗粒细胞的Vglut1样亚区表达模式**
在皮层，PRRT2在各层均有分布，但第IV层表达相对较低，该层主要接收来自丘脑的Vglut2阳性投射。高倍成像显示PRRT2与Vglut1的共定位程度显著高于Vglut2或Vgat，提示PRRT2部分定位于皮层神经元的Vglut1阳性突触末梢。在丘脑，PRRT2在腹后内侧核和腹后外侧核的表达高于腹外侧核（ventral lateral nucleus, VL）和丘脑后核，该模式与Vglut1分布一致而与Vglut2呈负相关。在脑桥核——接收皮层第五层Vglut1阳性皮质脑桥投射——PRPR T2与Vglut1存在部分重叠，在高倍镜下共定位有限；然而PRRT2见于脑桥纵束（longitudinal fascicle of the pons, LFP）这一皮质传出纤维束，提示其表达于皮质脊髓束、皮质脑桥束或皮质延髓束的轴突中。在小脑分子层，PRRT2与Vglut1高度共定位于颗粒细胞平行纤维形成的突触前末梢；在颗粒层，PRRT2更多地见于颗粒细胞胞体膜而非神经毡，而Vglut1和Vglut2阳性末梢主要来源于脑桥小脑投射神经元（苔藓纤维）。综合而言，小脑颗粒细胞特异性表达PRPR T2，与既往多项研究一致。
**PRRT2在基底神经节呈现Darpp-32样表达模式**
在纹状体，PRRT2密集染色，低倍镜下与Vglut1（皮质纹状投射终末）、Vglut2（丘脑纹状投射终末）和Dat（黑质纹状多巴胺能投射）均有一定重叠，但高倍成像显示PRRT2与Vglut1共定位最为显著。重要的是，PRRT2不与Darpp-32阳性的中等多棘神经元胞体或树突共定位，也不与胆碱能神经元标志物胆碱乙酰转移酶（Chat）共标。在外侧苍白球，PRPT2与Darpp-32在神经毡和纹状体轴突中共定位，与Vgat在神经毡中共定位但不在轴突中，提示其定位于GABA能突触前末梢和轴突。在脚内核（entopeduncular nucleus, EPN），PRRT2表达于神经毡及穿行的轴突束中；与高倍成像显示Vgat部分共定位，而与Dat无共定位。定量共定位分析证实，PRRT2与Darpp-32阳性纹状体黑质投射轴突的高度重叠和相关性显著高于与Dat阴性对照的比较。在底丘脑核，PRRT2稀疏分布，与Darpp-32和Dat类似，与该区域缺乏纹状体或黑质致密部的直接投射一致。在黑质，PRRT2在网状部的表达显著高于致密部，与Vgat和Darpp-32部分共定位，而不与Vglut2或Dat共定位，提示PRRT2来源于纹状体黑质投射神经元；在黑质致密部，PRRT2几乎不与Dat共定位，表明多巴胺能神经元中PRPR T2表达匮乏。
**定量共定位分析支持PRRT2阳性神经元神经化学类型的区域依赖性差异**
研究人员对高倍图像进行了系统的定量共定位分析，以MCC和PCC作为共定位参数，并设立了Dat/Vgat、Vglut1/Vgat非共定位阴性对照及Stx1a/Vamp2共定位阳性对照。结果表明，在纹状体、大脑皮层、丘脑、脑桥核和小脑分子层，Vglut1的MCC和PCC值均显著高于阴性对照及其他标志物；而在外侧苍白球、脚内核和黑质网状部，Vgat和Darpp-32的共定位系数显著升高。这些量化结果与基于观察的解释高度一致，确认了PRRT2在多种皮层投射神经元终末区、纹状体投射神经元及小脑颗粒细胞中的表达。值得注意的是，PRPT2与各标志物的共定位系数均未超过阳性对照，这可能归因于PRRT2广泛的亚细胞定位不限于突触前末梢等特定区域。
**PRRT2在纹状体D1型和D2型特异性区域的定位**
鉴于皮质纹状体投射神经元分为连接D1受体（D1r）阳性直接通路和D2受体（D2r）阳性间接通路的两种类型，研究人员进一步分析了PRRT2在两种神经元对应区域的分布。利用尾侧纹状体中存在的D1r特异性和D2r特异性区域，通过三重免疫荧光染色发现，PRRT2在D1r特异性区域和D2r特异性区域的定位几乎均等，表明PRRT2在投射至直接通路和间接通路中等多棘神经元的皮质纹状体神经元中均有类似表达。
**讨论与总结**
研究人员在讨论部分系统比较了原代培养神经元与成年脑组织中PRRT2表达模式的异同。两者均显示PRRT2优先表达于兴奋性和抑制性神经元而非多巴胺能神经元，且呈现广泛的亚细胞分布特征。但在原代培养中Vglut1和Vglut2共定位程度相近，而在成年脑中Vglut1显著占优，这可能源于发育过程中的谷氨酸转运体亚型转换。研究特别强调了小脑颗粒细胞在PRRT2生理功能中的核心地位，支持了颗粒细胞特异性PRRT2缺失可复制系统性缺失所致PKD样表型的前期研究。在皮层-脑桥-小脑-丘脑环路中，PRRT2选择性表达于谷氨酸能神经元；而在皮层-基底神经节-丘脑环路中，其定位于皮层至纹状体的谷氨酸能输入末梢和纹状体至下游核团的GABA能输出末梢，提示PRRT2可能通过调控纹状体活动及其下游GPe、EPN和SNr的活动来影响运动促进和抑制。鉴于PRRT2已知可负向调控神经元兴奋性和神经递质释放，其在突触前末梢或轴突的定位支持其在抑制神经活动中的作用。
研究结论指出：尽管PRRT2广泛分布于全脑，但其优先表达于Vglut1阳性谷氨酸能神经元和GABA能神经元，而非多巴胺能或胆碱能神经元；PRRT2呈现环路依赖性表达模式——在皮层和小脑以兴奋性神经元表达为主，在基底神经节则以抑制性神经元表达为主。基底神经节可能是PRRT2调控运动功能和癫痫易感性的另一关键区域。PRRT2在基底神经节和小脑负责精细调节环路兴奋性的亚区或亚细胞区域的定位，印证了其在突触前位点或轴突抑制神经活动的作用，并为理解PRRT2突变小鼠的神经化学和行为学表型提供了重要依据。这些发现将为PRRT2功能、运动障碍及相关疾病的分子机制，以及神经环路兴奋性调控的未来研究提供关键信息。
