《Journal of Eukaryotic Microbiology》：Identification of Distinct Interacting Proteins of Giardia lamblia Centrins Using Yeast Two-Hybrid Assays
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摘要：蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)是一种引起人类腹泻的原虫寄生虫，含有两个参与细胞形态和细胞分裂的中心体蛋白(centrin，简称GlCent)。为鉴定与每种G. lamblia centrin相互作用的蛋白，研究人员进行了酵母双杂交(ye
摘要：蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)是一种引起人类腹泻的原虫寄生虫，含有两个参与细胞形态和细胞分裂的中心体蛋白(centrin，简称GlCent)。为鉴定与每种G. lamblia centrin相互作用的蛋白，研究人员进行了酵母双杂交(yeast two-hybrid, Y2H)试验。将两种centrin——GlCent1(GL50803_6744)和GlCent2(GL50803_104685)的编码序列克隆至pGBKT7载体作为诱饵(bait)构建体。将受pGADT7驱动的G. lamblia cDNA文库转化入表达各诱饵蛋白的酵母菌株。在选择性培养基上的初步筛选分别获得GlCent1和GlCent2候选克隆17和23个。经回转化及生长试验分析相互作用强度后，筛选出10个GlCent1相互作用克隆和5个GlCent2相互作用克隆。研究人员在共表达血凝素(hemagglutinin, HA)标签标记centrin和myc标签标记候选蛋白的转基因G. lamblia细胞中，利用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, co-IP)和免疫荧光(immunofluorescence assay, IFA)试验对相互作用进行了验证。结果显示泛素蛋白连接酶1(ubiquitin protein ligase 1, GL50803_9779)和植入前蛋白3(preimplantation protein 3, GL50803_3417)为GlCent1结合蛋白，而两个假定蛋白(hypothetical protein, GL50803_4239和GL50803_27739)与GlCent2相互作用。与两种centrin相互作用的蛋白在细胞分裂期间呈现瞬时共定位(transiently co-localized)。这些发现表明GlCent1和GlCent2可能通过在G. lamblia中结合不同的搭档蛋白参与细胞分裂。
论文解读：《Journal of Eukaryotic Microbiology》——利用酵母双杂交鉴定蓝氏贾第鞭毛虫中心体蛋白(Centrin)特异性相互作用蛋白
一、研究背景与立项依据
中心体蛋白(Centrin/Caltractin)是含EF-hand模体的钙结合蛋白，结构与钙调蛋白(calmodulin)相似，广泛存在于真核生物中，定位于微管组织中心(microtubule organizing center, MTOC)如中心体(centrosome)、纺锤体极体(spindle pole body, SPB)及纤毛/鞭毛的基体(basal body)，参与MTOC复制及纺锤体形成。蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)为双核、具鞭毛的古老原生动物，含两个centrin异构体GlCent1(GL50803_6744)和GlCent2(GL50803_104685)，前期研究显示其定位于基体、腹盘及轴丝，敲低后导致基体定位异常、核错位及细胞分裂缺陷，但其发挥功能的分子机制——即通过与何种搭档蛋白互作来调控细胞过程——尚不清楚。明确centrin的结合伴侣是揭示其在G. lamblia中功能的前提。因此，研究人员以GlCent1和GlCent2为诱饵，利用酵母双杂交(yeast two-hybrid, Y2H)筛选G. lamblia滋养体(trophozoite) cDNA文库，鉴定特异性互作蛋白，并通过体外及细胞内实验进行多层次验证。
二、主要关键技术方法
研究人员采用的主要技术方法包括：(1)以G. lamblia WB株(ATCC 30957)滋养体提取基因组DNA及cDNA，构建pGBKT7-GlCent1和pGBKT7-GlCent2诱饵质粒及pGADT7驱动的G. lamblia cDNA表达文库，转化酵母菌株AH109进行Y2H初筛与回返验证；(2)谷胱甘肽-S-转移酶pull-down(GST pull-down)试验，利用大肠杆菌BL21(DE3)表达并纯化GST-GlCent及His标签候选蛋白，检测直接物理结合；(3)电穿孔法将HA标签GlCent与myc标签候选蛋白表达载体共转染G. lamblia滋养体，建立稳定共表达转基因株；(4)免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, co-IP)检测细胞内天然复合物形成；(5)甲醛固定及荧光标记抗体的免疫荧光试验(immunofluorescence assay, IFA)，计算Pearson相关系数(Pearson's correlation coefficient, PCC)评估分裂期共定位。
三、研究结果
3.1 利用酵母双杂交试验筛选GlCent1和GlCent2相互作用候选蛋白(Yeast two-hybrid screening)
以GlCent1和GlCent2为诱饵筛选G. lamblia cDNA文库，初筛分别获17和23个在-SD/-AHLT/X-α-gal生长并显蓝色的克隆。测序比对GiardiaDB后确认GlCent1候选13个(unique克隆，含泛素蛋白连接酶1、植入前蛋白3、假定蛋白等)，GlCent2候选9个(unique克隆，含假定蛋白GL50803_4239与GL50803_27739、烯醇酶等)。两组的互作候选蛋白完全无重叠，提示GlCent1与GlCent2功能特异性不同。
3.2 候选克隆与GlCent1或GlCent2相互作用的验证(Validation of candidate clones)
将候选cDNA质粒回转化对应诱饵酵母菌株，在缺失培养基上评估互作强度。10个GlCent1候选和5个GlCent2候选能在中等严刻度(-HLT/X-α-gal)平板上生长，被选入后续实验。其中仅少数在最高严刻度(-AHLT/X-α-gal)生长，说明互作强度存在差异。
3.3 GST pull-down试验证实GlCent与候选蛋白的物理相互作用(GST Pull-Down Assays)
体外重组GST-GlCent1与His标签候选蛋白孵育后，GlCent1直接结合GL50803_15255、10311、17495、3098、5908、9779、15026、3417中的8个His标签蛋白；GlCent2直接结合GL50803_16522、27739、11118。部分Y2H阳性候选(如GL50803_95023、14458对GlCent1；GL50803_17254、4239对GlCent2)未在pull-down中检出，提示可能通过间接方式或多蛋白复合体互作。
3.4 共免疫沉淀验证G. lamblia滋养体内GlCent-蛋白复合物(Co-Immunoprecipitation in Giardia)
在共转染HA-GlCent与myc-候选蛋白的G. lamblia细胞中，抗myc抗体IP后检测到GlCent1与3098-myc、5908-myc、14458-myc、9779-myc、15026-myc、3417-myc形成稳定复合物(n=6/10)；GlCent2与全部5个候选(17254-myc、4239-myc、16522-myc、27739-myc、11118-myc)共沉淀。IgG对照无信号，证明细胞内特异性互作。
3.5 GlCent与其互作蛋白在G. lamblia细胞分裂期的亚细胞共定位(Subcellular Co-Localization)
IFA显示：GlCent1仅与泛素蛋白连接酶1(UPL1, GL50803_9779)及植入前蛋白3(GL50803_3417)在后期(anaphase)和末期(telophase)于基体侧方发生瞬时共定位(PCC分别为0.54±0.13与0.75±0.11，后期；0.46±0.13与0.76±0.11，末期)，间期及胞质分裂期无共定位。GlCent2仅与假定蛋白GL50803_4239(后期、末期、胞质分裂期PCC 0.62~0.65)及GL50803_27739(主要在后期的PCC 0.59±0.13)在基体间区共定位。其余co-IP阳性但未显示共定位的候选可能因互作过于瞬变或受固定条件限制未被捕获。
四、讨论与结论总结
讨论指出：(1)Y2H结合GST pull-down与细胞内co-IP可区分直接互作与间接/多亚基复合体互作，部分G. lamblia特异翻译后修饰(如SUMOylation、磷酸化)可能影响体内互作，这解释了体外与体内结果差异；(2)鉴定的GlCent互作蛋白含已知结构域(干扰素相关发育调节域、核苷磷酸化酶域、WD40重复域、Mob1家族域)及经AlphaFold预测的假定结构域(CCT域、SPRY域、SRβ/GTP酶域、LRR域)，暗示其可能参与蛋白折叠、适配、内质网靶向及信号调控；(3)GlCent1与GlCent2互作物完全不同，表明两异构体非功能冗余，可能分别通过不同互作网络调控G. lamblia细胞分裂与细胞骨架组织；(4)UPL1(GlCent1)及GL50803_4239(GlCent2)在包囊(cyst)阶段与对应centrin有相似上调趋势，提示可能共同参与生活史其他阶段；(5)部分互作蛋白只在分裂特定时相共定位，说明centrin-蛋白复合物组装受细胞周期调控。
研究结论：研究人员通过酵母双杂交筛选并结合GST pull-down、共免疫沉淀及免疫荧光分析，鉴定出GlCent1特异性结合泛素蛋白连接酶1(ubiquitin protein ligase 1, GL50803_9779)和植入前蛋白3(preimplantation protein 3, GL50803_3417)，GlCent2特异性结合两个假定蛋白(hypothetical protein, GL50803_4239和GL50803_27739)。这些互作蛋白与对应centrin在G. lamblia细胞分裂的后段及末段呈瞬时共定位。结果表明GlCent1和GlCent2可能通过与不同伙伴蛋白关联而参与G. lamblia的细胞分裂过程。
