《Journal of Medical Virology》：CRISPR-Cas13a/Cas12a Assisted Dual Portable and Visualized HDV and HBV Detection
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乙型肝炎病毒（HBV）和丁型肝炎病毒（HDV）的合并感染可加剧终末期肝病的严重程度并加速其进展。然而，目前尚无针对HDV和HBV核酸的联合诊断方法。在本研究中，研究人员利用CRISPR-Cas系统开发了一种高灵敏度、高特异性的HDV RNA和HBV DNA双重
乙型肝炎病毒（HBV）和丁型肝炎病毒（HDV）的合并感染可加剧终末期肝病的严重程度并加速其进展。然而，目前尚无针对HDV和HBV核酸的联合诊断方法。在本研究中，研究人员利用CRISPR-Cas系统开发了一种高灵敏度、高特异性的HDV RNA和HBV DNA双重检测方法。研究人员建立了一种结合CRISPR-Cas12a与重组酶聚合酶扩增（RAA）用于HBV检测，以及CRISPR-Cas13a与RT-RAA用于HDV检测的双重检测方法。使用来自70例合并感染患者的标本进行了验证。研究人员设计并优化了RAA引物和crRNA，在同一个CRISPR-Cas13a/Cas12a系统中建立了针对HDV RNA和HBV DNA的双重荧光检测方法（DF）和基于侧流层析试纸条的双重检测方法（DL）。该系统表现出100%的特异性，且DF和DL方法对合成阳性质粒和样本的灵敏度均达到10拷贝/μL。使用T7 RNA聚合酶时荧光检测峰值最高，而最佳检测效率出现在ssRNA: ssDNA比例为1:1.5时。在70例合并感染临床患者的血浆样本验证中，RT-RAA-CRISPR-Cas13a/Cas12a DF和DL的阳性符合率分别为85.7%（60/70）和82.9%（58/70）。研究人员开发了一种基于CRISPR-Cas13a/Cas12a的双重检测方法，用于灵敏、特异且准确地检测HDV RNA和HBV DNA，为HDV和HBV感染的早期检测、治疗和监测提供了有效工具。
**研究背景与问题**
世界卫生组织（WHO）计划于2030年前消除病毒性肝炎这一公共卫生威胁。全球约2.96亿人感染乙型肝炎病毒（HBV），其中超过1000万罹患慢性乙型肝炎（CHB），每年约82万人死亡。丁型肝炎病毒（HDV）是一种缺陷病毒，依赖HBV进行生存、感染和复制。HDV与HBV合并感染可导致慢性丁型肝炎（CHD），加重终末期肝病的严重程度并加速其进展，使CHD成为最严重的病毒性肝炎形式之一。然而，目前尚无临床方法可同时检测HBV和HDV，这构成了诊断策略中的关键空白。由于HDV诊断能力有限，全球感染率估算差异巨大（1200万至7200万），全球HDV感染诊断率仅约20%-50%。现有HBV DNA检测常用定量实时PCR（qPCR），但需专业人员和设备，偏远地区大规模筛查困难。HDV的传统血清学诊断常检测抗HDV抗体（IgM和IgG），但抗体检测存在局限：感染早期病毒载量快速上升而抗体可能尚未出现；而HDV RNA被认为是诊断HDV感染的“金标准”。因此，迫切需要开发同时检测HBV DNA和HDV RNA的双重方法。
**研究内容与意义**
研究人员开发了基于CRISPR-Cas13a和Cas12a的双重检测系统，用于高灵敏度、高特异性检测HDV RNA和HBV DNA。该系统结合了逆转录重组酶聚合酶扩增（RT-RAA）和重组酶聚合酶扩增（RAA），实现了荧光和侧流层析试纸条双重检测。结果显示，系统灵敏度达10拷贝/μL，特异性100%。在70例合并感染患者样本中，双重荧光检测（DF）阳性符合率85.7%，双重侧流检测（DL）阳性符合率82.9%。该方法为HDV和HBV感染的早期筛查、治疗监测提供了快速便捷的工具。论文发表在《Journal of Medical Virology》。
**主要关键技术方法**（不超过250字）
研究人员从首都医科大学附属北京佑安医院收集了70例HDV相关感染患者（抗HDV IgG阳性）和10例健康对照的血浆样本。主要技术包括：1）多重序列比对（MAFFT）设计保守区域的RT-RAA/RAA引物和crRNA；2）体外转录合成HDV RNA模板，并利用CRISPR-Cas13a荧光检测筛选最佳crRNA和引物组合；对于HBV，直接使用CRISPR-Cas12a检测筛选。3）建立双重荧光检测（DF）体系：在同一个反应管中同时加入Cas13a、Cas12a、相应crRNA、ssRNA和ssDNA荧光报告分子，37℃检测60分钟。4）建立双重“线消失”侧流层析试纸条检测（DL）体系：基于胶体金标记的抗体，通过T1（DNA靶标）和T2（RNA靶标）线信号的消失判断结果。5）采用双重RT数字PCR（RT-ddPCR）作为参考方法进行验证。
**研究结果**（保留每个小标题）
**3.1 Schematic of RT-RAA-CRISPR-Cas13a/Cas12a Dual Detection Assay**：研究人员设计了双重检测示意图，样品RNA和DNA经RT-RAA等温扩增后，分别由Cas13a（识别RNA）和Cas12a（识别DNA）系统检测，通过荧光或侧流条可视化信号。
**3.2 Design and Screening of Primers and crRNAs**：通过比对HDV 1-8基因型和所有HBV基因型的保守区域，筛选出最佳引物和crRNA。最终选择crRNA3和F3R1用于HDV RNA检测，crRNA1和F3R1用于HBV DNA检测，ssDNA5为最佳报告分子。
**3.3 Development of the Dual Fluorescence Detection Assay**：验证RT-RAA可同时扩增HDV RNA和HBV DNA，且与RAA扩增HBV DNA的灵敏度一致（均达1拷贝/μL）。确认Cas13a仅切割ssRNA报告分子，Cas12a仅切割ssDNA报告分子，无交叉反应。
**3.4 Optimization and Evaluation of Dual Detection Assay for HDV and HBV**：优化了反应条件，最佳rNTP浓度为2 mM，T7 RNA聚合酶为50 U/μL，NEB Buffer r1.1，ssRNA:ssDNA比例为1:1.5。灵敏度评价显示，荧光检测对合成质粒和阳性样本均达10拷贝/μL。特异性检测显示与HCV、HEV、HIV无交叉反应。
**3.5 CRISPR-Cas13a/Cas12a-Based Dual Lateral Flow Strip Detection Assay**：开发了基于“线消失”原理的双重侧流条，T1线对应DNA靶标，T2线对应RNA靶标。当仅存在HBV DNA时，T1消失；仅存在HDV RNA时，T2消失；两者均存在时，两线均消失；均不存在时，两线均显示。
**3.6 Evaluation and Validation of Dual Lateral Flow Strip Detection Assay**：侧流条检测对质粒和阳性样本的灵敏度均为10拷贝/μL，特异性良好。在70例临床样本中，DF法检测HDV RNA阳性率87.1%（61/70），HBV DNA阳性率88.6%（62/70），两者同时阳性率85.7%（60/70）；DL法对应阳性率分别为84.3%、87.1%和82.9%。10例健康对照均阴性。
**讨论与结论**
当前缺乏同时检测HDV和HBV核酸的方法。标准流程通常先测HBV DNA，再测HDV抗体，但抗体检测存在滞后性。研究人员开发的基于CRISPR-Cas13a/Cas12a的双重检测方法可同时筛查两种感染，为及时诊断和治疗提供支持。系统通过保守区域设计实现了跨基因型兼容性。在70例患者中，DF阳性率略高于DL，但DL更便捷、无需大型设备，适合筛查。研究存在局限性：临床样本可进一步扩展以验证真实世界性能；未来需优化crRNA设计以提高检测率；目前两步法操作不够简便，拟结合冻干技术和分隔腔室实现一步检测；同时探索快速核酸裂解缓冲液以支持资源有限环境中的即时检验。总之，研究人员开发了高灵敏度、高特异性、快速易用的RT-RAA-CRISPR-Cas13a/Cas12a双重荧光和侧流条检测方法，为HDV和HBV合并感染的筛查、诊断、治疗监测提供了有力工具，有望显著改善病毒感染的临床管理。
