黄酮类化合物与血管紧张素转化酶2（Angiotensin-Converting Enzyme 2，ACE2）的变构相互作用及其对COVID-19的启示：芦丁（Rutin）与ACE2结合的计算洞察及在A549细胞中代谢与线粒体效应

《Cell Biochemistry and Biophysics》：Allosteric Interactions of Flavonoids with ACE2 and Potential Implications for COVID-19: Computational Insights, Metabolic and Mitochondrial Effects of Rutin in A549 Cells

　　

由于疾病机制的日益复杂，寻找新治疗靶点和药物的需求迫切。血管紧张素转化酶2（Angiotensin-Converting Enzyme 2，ACE2）作为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2）的主要宿主受体，在COVID-19病理生理中起关键作用，是潜在生物靶点。识别可与ACE2相互作用的小分子有助于探索靶向宿主的策略，影响病毒入侵及ACE2相关细胞通路。研究人员通过计算与体外实验评估选定黄酮类化合物与ACE2的变构（allosteric）相互作用，以及在A549细胞中候选物的细胞毒性与代谢效应。分子对接发现黄酮类化合物可结合ACE2，随后进行120 ns分子动力学（Molecular Dynamics，MD）模拟以表征ACE2-黄酮复合物稳定性与动态行为。采用分子力学/广义玻恩表面积（Molecular Mechanics/Generalized-Born Surface Area，MM/GBSA）结合自由能计算及每残基能量分解，鉴定稳定配体结合的关键相互作用。计算机分析显示ARG255、PRO328、GLU357、GLU384、GLU388和ARG500是贡献ACE2-黄酮复合物稳定性的关键变构残基。芦丁（Rutin）表现出最有利的结合亲和力，其次为异槲皮苷（Isoquercetin）。基于计算结果，选用芦丁在A549细胞中通过MTT法、ATP定量、线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential，MMP）、细胞色素P450 3A4（Cytochrome P450 3A4，CYP3A4）活性及乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）释放评价细胞毒性、代谢及线粒体效应。体外分析表明，≤500 μM芦丁无细胞毒性，可提升ATP产量且不 adversely影响MMP与细胞膜完整性。研究结果表明芦丁与ACE2形成稳定相互作用，有可能在不诱导细胞毒性的情况下影响细胞能量代谢，对线粒体功能障碍和代谢应激相关疾病具治疗益处。虽未实验证实直接ACE2酶活性调节，但结果为进一步研究ACE2-黄酮相互作用及其在ACE2相关疾病中的潜在生物学意义提供机制基础。

研究背景与目的

血管紧张素转化酶2（Angiotensin-Converting Enzyme 2，ACE2）是肾素-血管紧张素-醛固酮系统（Renin-Angiotensin-Aldosterone System，RAAS）的关键组分，可将血管紧张素II（Angiotensin II，Ang II）转化为血管舒张肽血管紧张素1–7（Ang 1–7），发挥抗炎、抗氧化及心脏保护作用。SARS-CoV-2通过其刺突蛋白受体结合域（Receptor-Binding Domain，RBD）与ACE2结合入侵宿主细胞，此过程会干扰ACE2正常功能，诱发过度炎症反应与肺损伤。既往抗SARS-CoV-2药物研发多聚焦于病毒主蛋白酶（Main Protease，M^pro）、RNA依赖RNA聚合酶（RNA-Dependent RNA Polymerase，RdRp）及刺突蛋白，对宿主因子ACE2的关注较少，且担忧干扰其生理功能。黄酮类化合物（Flavonoids）是植物源生物活性分子，具抗氧化、抗炎及抗病毒潜力。阐明黄酮类化合物与ACE2的分子相互作用，可为开发通过变构（allosteric）调节ACE2、抑制病毒结合并保留其生理功能的宿主靶向疗法提供依据。该研究旨在通过计算与体外实验，评估选定黄酮类化合物与ACE2的变构结合能力、复合物稳定性，以及优选化合物对肺上皮细胞的安全性及代谢/线粒体影响。

该研究发表于《Cell Biochemistry and Biophysics》。

主要关键技术方法

研究人员采用PDB编号1R4L的人ACE2蛋白结构与PubChem来源黄酮配体进行分子准备后，使用AutoDock Vina进行分子对接初筛；选取高分黄酮-ACE2体系在Amber18中以FF14SB与GAFF力场开展120 ns全原子分子动力学（MD）模拟，通过均方根偏差（Root Mean Square Deviation，RMSD）、均方根涨落（Root Mean Square Fluctuation，RMSF）、回转半径（Radius of Gyration，RoG）、氢键分析及主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）评价复合物动态稳定性；采用MM/GBSA法计算结合自由能并做每残基能量分解。体外部分选用A549人肺腺癌细胞系，通过MTT法测细胞活力，发光法检测ATP水平与CYP3A4活性，JC-10荧光探针测线粒体膜电位（MMP），比色法测培养上清LDH释放评价膜完整性。

研究结果

分子对接筛选：分子对接显示异鼠李素（Isorhamnetin）、芦丁（Rutin）及杨梅素（Myricetin）对接分值分别为-9.20、-9.10及-9.10 kcal/mol，各黄酮差异微小，共结晶配体（Co-Crystallized Ligand，CCL）分值略低。因对接打分局限，研究人员将前四位黄酮纳入MD模拟。

分子动力学（MD）模拟—均方根偏差（RMSD）：无配体ACE2（Apo）平均RMSD达2.40 ?且40 ns后波动大，未收敛；黄酮及CCL结合组于10 ns达平衡，RMSD稳定在2.0 ?以下。芦丁、异槲皮苷与CCL平均RMSD分别为1.78、1.64及1.73 ?，表明配体结合增强ACE2构象稳定性，芦丁与异槲皮苷具明显受体稳定作用。

分子动力学（MD）模拟—均方根涨落（RMSF）：Apo-ACE2平均RMSF为1.21 ?，残基灵活性高；配体结合降低残基波动，其中芦丁RMSF最低（0.81 ?），次之为异槲皮苷（0.84 ?）与CCL（0.85 ?）。ACE2变构结合区（残基150–500）波动最小，提示稳定持续相互作用；N端柔性环区（残基100–150）存固有波动，暗示变构配体可能间接影响RBD结合域附近构象。

分子动力学（MD）模拟—回转半径（RoG）：Apo组RoG波动显著；配体结合组10 ns后RoG稳定（23.86–24.20 ?），异槲皮苷与CCL使ACE2呈较紧密折叠，芦丁结合模式略具动态但仍维持结构紧凑，未引起有害构象变化。

氢键分析：总氢键数在293–314间波动，60 ns后略降。异槲皮苷与CCL维持较高氢键数。关键残基VAL467在各复合物中氢键占有率最高，GLU477亦参与稳定结合；芦丁与异槲皮苷同VAL467、GLU477形成短距（2.66–2.77 ?）、高占有率氢键，支持复合物稳定性。

分子力学/广义玻恩表面积（MM/GBSA）结合自由能：芦丁具最有利结合自由能（ΔG_bind= -56.44 ± 8.31 kcal/mol），优于CCL（-46.88 ± 13.94）、异槲皮苷（-46.53 ± 7.02）、槲皮素（Quercetin，-32.86 ± 3.41）及异鼠李素（-17.77 ± 4.07）。芦丁与异槲皮苷的范德华（van der Waals，vdW）贡献最强（分别-58.71 ± 5.18与-47.51 ± 3.65 kcal/mol），且具显著静电贡献，表明非极性作用与氢键共同稳定复合物。糖基化（C-3位）增强黄酮与ACE2结合，而B环C-3'位甲基化（异鼠李素）减弱亲和力。

每残基能量贡献（Per Residue Energy Contribution）：GLU357与GLU388对芦丁、异槲皮苷及槲皮素具较大负静电贡献；CCL主要经ARG496与ARG255强静电作用结合。异鼠李素vdW贡献弱于另几种黄酮，与较低结合能相符。

结合模式分析与ACE2-配体相互作用：黄酮类化合物结合于不同于ACE2催化位点（HIS374、HIS378、GLU402、LYS562、ASP368、TYR515）及SARS-CoV-2 RBD正统结合位点（LYS31、GLU35、ASP38、LYS353）的区域，判定为变构位点。关键互作残基含ARG255、PRO328、GLU357、GLU384、GLU388、ARG500等；芦丁与异槲皮苷可形成多重氢键及σ-π堆积，其中GLU384、GLU388与酚羟基成氢键，ARG500与糖基部分作用。变构调节有望干扰RBD结合而不破坏ACE2酶功能。

主成分分析（PCA）：芦丁与异槲皮苷复合物构象集中于均值附近、离散度小，印证RMSD/RoG结论——配体诱导有限构象变化且结合稳定；Apo组分散度最大。

芦丁在A549细胞的细胞毒性与代谢及线粒体效应—MTT法：25–500 μM芦丁处理24 h，A549细胞存活率约91%–100%，无显著毒性（p > 0.05），IC₅₀未达。

芦丁在A549细胞的细胞毒性与代谢及线粒体效应—ATP定量：50、250及500 μM芦丁均显著提升细胞内ATP水平（p < 0.05或p < 0.001），提示增强细胞能量状态且线粒体功能未受损。

芦丁在A549细胞的细胞毒性与代谢及线粒体效应—线粒体膜电位（MMP）：JC-10红/绿荧光比随芦丁浓度升高而增加（p < 0.05或p < 0.01），表明线粒体膜去极化未发生，膜电位维持或升高，线粒体健康。

芦丁在A549细胞的细胞毒性与代谢及线粒体效应—LDH释放：各浓度芦丁组培养上清LDH活性与对照组比无显著差异，说明细胞膜完整性未被破坏，无坏死性损伤。

芦丁在A549细胞的细胞毒性与代谢及线粒体效应—CYP3A4活性：50与250 μM芦丁轻度诱导CYP3A4活性，500 μM略抑制，呈浓度依赖性双向调节，提示临床合并用药时需关注代谢酶影响。

讨论与结论翻译

本研究探讨了选定黄酮类化合物与ACE2（一种参与COVID-19及心血管代谢疾病病理生理的重要蛋白）的相互作用。借助计算方法，研究结果提供了黄酮类化合物与ACE2结合的构效关系、构象稳定性及相互作用模式的结构见解，可能有助于ACE2靶向药物设计及其潜在调节。分子对接与MD模拟显示芦丁和异槲皮苷与ACE2形成稳定复合物，有利的绑定能与一致的轨迹指标（RMSD、RMSF、RoG及MM/GBSA分析）支持该结论。两化合物均与结合口袋中关键残基ARG255、PRO328、GLU357、GLU384、GLU388及ARG500相互作用，提示潜在的变构结合机制。所观察结合未涉及催化结构域破坏，表明此种条件下ACE2酶功能可能被保留。互补性体外实验证明芦丁在测试浓度下对A549细胞无细胞毒性，且与改善的细胞能量状态相关，显示出良好的安全性与代谢特征。这对潜在先导化合物十分重要，细胞安全性和代谢稳定性是进一步开发的关键因素。这些发现为计算预测提供了初步互补体外研究，但未直接确立ACE2调节或抗病毒活性。结果表明此类黄酮类化合物特别是芦丁可作为通过非催化位点相互作用靶向ACE2的潜在先导化合物。然而，潜在调节功能与治疗意义主要基于计算预测与初步体外结果，需药理学研究确认这些化合物影响ACE2功能或干扰SARS-CoV-2结合的能力。虽然分子对接与动力学模拟指示芦丁与ACE2稳定相互作用，本研究存在局限：缺乏直接实验（如酶活性测定、生物物理结合测量、蛋白或基因表达分析）验证ACE2调节；未包含病毒进入或Spike-ACE2结合实验，故发现与病毒入侵机制之关联待定；A549细胞内生ACE2表达低，在功能性ACE2研究中局限性高于原代气道上皮细胞。未来研究宜采用ACE2过表达细胞模型、原代气道上皮细胞、病毒进入实验及靶向机制研究，以验证预测的ACE2-黄酮复合物相互作用，并阐明芦丁与异槲皮苷对ACE2信号及SARS-CoV-2结合干扰的生物学意义。

综上，本研究聚焦计算分析以理解特定黄酮类化合物与ACE2相互作用，确定芦丁为与ACE2受体具稳定相互作用、在A549细胞中无细胞毒性且有益影响细胞代谢活性的化合物。结果为探索可能相互作用并作为宿主蛋白（参与重要生理及疾病相关通路）潜在调节物的天然产物提供了依据。最终，这些计算发现为未来机制研究奠定基底，并提示干扰SARS-CoV-2与ACE2受体结合的潜在结构基础，但不构成ACE2调节或抗病毒活性的直接证据。