使用二次谐波(Second Harmonic Generation, SHG)显微镜评估扁桃体组织中成熟与未成熟胶原

《Journal of Microscopy》：Assessing mature and immature collagen in tonsillar tissue using second harmonic generation microscopy

　　

复发性扁桃体炎（Recurrent Tonsillitis, RT）与阻塞性睡眠呼吸暂停（Obstructive Sleep Apnoea, OSA）是扁桃体切除术的主要指征，但其组织水平病理机制尚不清楚。RT中的反复炎症可能通过过量的细胞外基质沉积诱导胶原重塑。本研究使用无标记二次谐波（Second Harmonic Generation, SHG）显微镜，定量比较了RT与OSA患者腭扁桃体中前向与后向SHG信号比值（Forward-to-Backward SHG signals）的面积分数。结果显示，OSA组的前向/后向SHG信号比值平均面积分数高于RT组，这与既往免疫组化染色方法的趋势一致；然而，差异无统计学意义。对上皮优势区域及组织内部区域的空间分析显示，OSA组的前向/后向SHG信号高于RT组；但这两项测量均无统计学意义。这些结果证明了一种使用SHG显微镜测量OSA与RT腭扁桃体内胶原分布的新方法。

论文解读：使用二次谐波显微镜评估扁桃体组织中成熟与未成熟胶原

研究背景与意义

复发性扁桃体炎（RT）与阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）是临床常见的扁桃体疾病，常需行扁桃体切除术。RT多发于5–15岁儿童，表现为咽痛、发热及吞咽困难；OSA则因腺样体扁桃体肥大导致上气道阻塞，多见于2–8岁儿童，可引起日间嗜睡、打鼾及注意力下降。目前两种疾病的组织水平病理生理机制尚未完全明确。胶原作为体内最丰富的结构蛋白，尤其是Ⅰ型胶原，在扁桃体细胞外基质中扮演关键角色。成熟胶原提供结构强度，未成熟胶原则参与早期修复与纤维化过程。RT的慢性炎症可能引发成纤维细胞失调，导致未成熟胶原过度积聚，促进组织纤维化与复发感染。传统评估方法如免疫组化与吸收染色存在视野小、非特异性结合及光漂白等偏差。因此，研究人员开展此项研究，利用无标记二次谐波（Second Harmonic Generation, SHG）显微镜，通过检测前向（F-SHG，主要对应成熟胶原）与后向（B-SHG，主要对应未成熟胶原）信号，定量比较RT与OSA扁桃体组织中胶原分布与成熟度，以探寻更可靠的组织评估方法。论文发表于《Journal of Microscopy》。

主要关键技术方法

研究人员纳入英国格拉斯哥皇家儿童医院标本，经NHS Greater Glasgow and Clyde生物样本库管理委员会批准（NHS Biorep 548），共15例扁桃体标本（RT组8例，OSA组7例）。组织快速冷冻包埋后切为20 μm厚切片，固定封片。使用Leica SP5激光扫描显微镜，以850 nm飞秒脉冲钛蓝宝石激光激发胶原SHG信号，分别用PMT 1检测后向SHG（420–430 nm）、PMT 3检测前向SHG（420–430 nm），并以488 nm氩激光激发组织自发荧光（PMT 2，505–751 nm）作为组织面积参照。采用20×/0.75 NA空气物镜，结合图像拼接覆盖毫米级组织区域，每个标本选取5个感兴趣区（ROI），部分ROI进一步划分为上皮优势区与内部区。原始数据以最大强度投影处理，通过Fiji软件进行背景扣除与阈值分析，计算归一化前向/后向SHG面积分数比值（F/B），采用Mann–Whitney U检验进行组间比较，GraphPad Prism绘图。

研究结果

3.1 SHG成像揭示RT与OSA扁桃体组织前向与后向SHG信号丰度及定位差异

通过代表性图像可见，RT组扁桃体组织中成熟与未成熟Ⅰ型胶原 visually均较OSA组更丰富。空间上，两类胶原均靠近上皮分布；RT组内部区域也可见胶原，而OSA组内部胶原信号较弱。

3.2 RT扁桃体具有更低的前向/后向（F/B）SHG信号比值

对13例扁桃体（RT去除2个离群值后n=8；OSA去除1个后n=7）分析显示，RT组平均F/B比值为0.19，OSA组为0.66，RT组低于OSA组，但差异无统计学意义（p=0.39）。

3.3 在上皮与内部区域，RT的F/B SHG比值仍低于OSA

将ROI划分为上皮优势区与内部区后，上皮区RT平均F/B=0.18（n=8，去1离群），OSA=0.82（n=7，去2离群），p=0.43；内部区RT平均F/B=0.21（n=8，去2离群），OSA=0.72（n=7，去2离群），p=0.54。两组区域均为RT低于OSA，但均无统计学意义。

3.4 RT扁桃体前向与后向SHG信号绝对面积分数均高于OSA

单独分析前向与后向信号，RT组前向SHG均值1.87（n=8，去1离群）、后向10.56（n=8，去1离群）；OSA组前向1.16（n=7，去1离群）、后向6.32（n=7，去1离群）。RT组两项信号均高于OSA组，但差异仍无统计学意义（前向p=0.44，后向p=0.53）。

讨论与结论总结

研究人员讨论认为，OSA的F/B比值高于RT的趋势与既往吸收染色研究一致，但本研究未达统计学显著，可能与样本量较小有关。SHG无标记成像避免了染色结合偏差与组织损伤，能更可靠地反映胶原分布。单纯胶原丰度差异不足以说明Ⅰ型胶原在RT炎症进程中起主导作用。从免疫调节角度看，IL-10表达与扁桃体肥大程度相关，可调控成纤维细胞胶原合成；IL-37在肥大扁桃体中略高，具有抗纤维化潜力；IL-1及TGF-β等细胞因子亦参与气道胶原重塑。未来可联合细胞因子检测进一步解析胶原动态。

结论部分翻译

研究人员提出了一种无标记多模态显微方法，用于可视化复发性扁桃体炎与阻塞性睡眠呼吸暂停两种疾病扁桃体中主要以未成熟与成熟Ⅰ型胶原的分布。通过图像分析定量F/B SHG信号平均面积分数，观察到OSA较RT更丰富，但无统计学意义。这表明胶原丰度及成熟化不太可能在RT相关炎症过程中起主要作用。重要的是，结果凸显了染色技术潜在的偏差，免疫组化标记可能因不完全或非特异性结合而混淆结果。相反，无标记方法能更可靠地评估病变扁桃体组织中Ⅰ型胶原的丰度与分布。此外，使用低倍（20×/0.75 NA）物镜可对更大组织区域成像，为RT与OSA扁桃体组织Ⅰ型胶原提供了更全面的分析。