一个单一疏水残基增强短阳离子富脯氨酸细胞穿透肽的摄取

《Journal of Peptide Science》：A Single Hydrophobic Residue Enhances the Uptake of Short Cationic Proline-Rich Cell-Penetrating Peptides

　　

阳离子细胞穿透肽（CPPs）是用于将货物递送至哺乳动物细胞内的多功能平台，但常受限于低细胞摄取和内体捕获。研究人员研究了单个环己基丙氨酸（Cha）残基在由(4S)-胍基脯氨酸（Gup）组成的短构象受限阳离子肽末端的影响。研究人员表明，该疏水残基促进内化。研究还揭示，位于C末端的疏水残基比N末端更能增强细胞摄取。不同温度下的比较研究一致表明主要进入途径是通过直接跨越质膜转位。这些发现对CPPs的设计有用，尤其是增强原本弱细胞穿透肽的细胞转位。

论文解读文章

研究背景：阳离子细胞穿透肽（CPPs）是细胞内货物递送的重要工具，但许多短CPPs面临低摄取效率和内体捕获问题。已有研究发现疏水基团的引入可改善CPPs的膜穿透能力，但疏水残基的位置和种类对摄取效率的影响尚未明确。为系统探究该问题，研究人员利用具有聚脯氨酸II（PPII）螺旋构象的刚性寡脯氨酸支架，以(4S)-胍基脯氨酸（Gup）为阳离子单元，研究单个环己基丙氨酸（Cha）残基在短阳离子肽末端的效应。该研究旨在为设计高效、低内体捕获的CPPs提供策略。论文发表在《Journal of Peptide Science》。

主要关键技术方法：研究人员采用手动固相肽合成（SPPS）制备肽段，并利用5(6)-羧基荧光素（CF）通过6-氨基己酸（Ahx）连接臂标记肽段。通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）评估肽的相对疏水性。使用圆二色谱（CD）监测肽的二级结构。细胞摄取实验在人乳腺癌细胞系MCF-7上进行，采用共聚焦显微镜定性观察和流式细胞术定量分析。为探究进入途径，在4°C和37°C下进行对比摄取实验。

研究结果：

**肽的设计与表征**：研究人员以弱穿透肽CF-Ahx-Z6-NH₂（Z6，含6个Gup单元）为模型，合成C末端或N末端含Cha的类似物（Z6-Cha和Cha-Z6）。CD光谱显示所有肽均保留PPII螺旋特征（最小吸收在203–206 nm，最大吸收在223–226 nm）。RP-HPLC保留时间表明，Cha的引入增加肽的疏水性，且N末端Cha（Cha-Z6）的疏水性增加幅度大于C末端Cha（Z6-Cha）。

**细胞摄取增强**：共聚焦显微镜观察表明，在37°C孵育1小时后，Z6在20 μM下几乎无细胞内荧光，而Z6-Cha和Cha-Z6在相同条件下显示明亮的细胞质和核内荧光，尤其核仁积聚，且无明显点状荧光（提示低内体捕获）。流式细胞术定量分析确认，Z6-Cha和Cha-Z6的摄取显著高于Z6，其中Z6-Cha的摄取效率最高：在15和20 μM时，Z6-Cha的摄取量分别是Z6的4倍和6倍，而Cha-Z6约为2倍。值得注意的是，尽管Cha-Z6疏水性更强，但Z6-Cha的摄取更高，提示C末端Cha更利于膜锚定。

**进入途径鉴定**：在4°C和37°C下比较摄取。流式结果显示，所有肽在4°C下的摄取与37°C相当或更高（特别在15和20 μM时），表明主要进入途径为不依赖能量的直接转位。共聚焦显微镜进一步证实，4°C孵育后细胞内荧光强烈且分布均匀，且无细胞形态异常。MTT实验确认肽无显著细胞毒性。

总结讨论：研究揭示了单个C末端疏水残基（Cha）能显著增强短阳离子CPPs（如Z6）的细胞摄取，且该修饰促进直接跨膜转位，避免内体捕获。这一简单策略可有效改善弱穿透肽的胞质递送效率。研究结论：在短阳离子肽末端引入单一环己基丙氨酸残基可增强几乎不内化的CPPs的细胞摄取，该疏水基团促进直接跨越质膜转位，从而避免内体捕获。因此，该修饰为提升短CPPs的摄取效率和胞质递送提供了实用策略。