子痫前期来源的小细胞外囊泡(small extracellular vesicles, sEVs)破坏血脑屏障(blood–brain barrier, BBB)完整性并在体外激活神经胶质细胞

《The Journal of Physiology》：Preeclampsia-derived small extracellular vesicles disrupt blood–brain barrier integrity and activate glial cells in vitro

　　

血脑屏障(BBB)的结构和功能性完整对于维持脑内稳态至关重要。子痫前期(preeclampsia, PE)以妊娠期新发高血压和内皮功能障碍为特征，常伴BBB破坏及神经系统并发症。小细胞外囊泡(small extracellular vesicles, sEVs)被认为是PE时BBB破坏的潜在驱动因子，但其对母体脑健康、尤其细胞水平的影响仍研究不足。本研究探讨PE来源sEVs(PE-sEVs)对BBB完整性及脑微血管内皮细胞(brain endothelial cells, BECs)、小胶质细胞(microglia)和星形胶质细胞(astrocytes)细胞反应的影响。研究人员从健康女性及晚发型PE女性血浆中分离循环sEVs，采用Transwell及微流控血脑屏障芯片(BBB-on-a-chip)系统，在人单层、双层或三层细胞模型中开展研究。模型中检测到sEV信号位于BECs内，符合细胞内摄取与转运；在内皮细胞层腔面对侧(abluminal side)也检出sEV来源 cargo，提示可能经屏障转移，但具体机制尚不清楚。PE-sEVs暴露伴随BECs蛋白组成及亚细胞定位改变，并引起BBB功能改变，包括通透性增加。此外，星形胶质细胞和小胶质细胞对PE-sEVs产生反应，表现为IBA1和GFAP表达升高、IL-6释放增加及星形胶质细胞迁移增强。上述发现提示循环sEVs（含胎盘来源）可能通过影响BBB完整性和激活神经胶质细胞参与PE母体脑改变，表明循环sEVs作为生物标志物及疾病病理生理机制中的潜在作用。

论文解读：子痫前期来源的小细胞外囊泡(sEVs)破坏血脑屏障完整性并在体外激活神经胶质细胞

研究背景与立题依据

血脑屏障(blood–brain barrier, BBB)是由脑微血管内皮细胞(brain endothelial cells, BECs)紧密连接构成的特化结构，是神经血管单元(neurovascular unit, NVU)的核心组分，星形胶质细胞(astrocytes)和小胶质细胞(microglia，脑内驻留免疫细胞)对其结构与功能稳态至关重要。子痫前期(preeclampsia, PE)是一种发生于妊娠20周后的严重并发症，以新发高血压伴广泛内皮功能障碍为特点，全球发病率约3–8％，可致母体及胎儿发病与死亡，患者常出现头痛、癫痫、视觉障碍等神经系统症状，影像学可见后可逆性脑病综合征(posterior reversible encephalopathy syndrome, PRES)及脑水肿，且PE病史女性远期脑血管疾病及持续性BBB渗漏风险升高。已有动物实验提示PE血浆可改变脑血流调节并增加BBB通透性，但BBB损伤超出急性神经并发症的机制未明。妊娠期间血浆细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)浓度生理性升高，PE时间进一步升高，其中小细胞外囊泡(small extracellular vesicles, sEVs，多指外泌体范畴)可携带胎盘来源炎性或调控性cargo。既往研究证实外源性sEVs可在体内穿越BBB进入小鼠脑实质，胎盘来源sEVs存在于母体循环，但其对BBB本身及脑内实质细胞（特别是神经胶质细胞）的影响缺乏在体外的系统性研究。本研究假设循环sEVs——部分源自胎盘——可作为胎盘—脑轴介质，通过损害BBB完整性及激活神经胶质细胞参与PE相关母体脑改变，并采用人源静态及动态BBB-on-a-chip模型验证该假设。该论文发表于The Journal of Physiology。

主要关键技术方法

研究人员招募德国耶拿大学医院2018–2021年受试者，排除多胎、胎儿畸形及感染，采集晚发型PE（≥34孕周，n=17）及正常妊娠(normal pregnancy, NP, n=13)产妇枸橼酸抗凝外周血，差速超离心法分离血浆sEVs并PKH67标记，纳米颗粒示踪(nanoparticle tracking analysis, NTA)、Western blot检测ALIX/CD63/TSG101/PLAP-1及qPCR检测胎盘相关miRNA(miR-141-3p/miR-517a-3p/miR-519d-3p/miR-520d-3p)进行表征。采用人脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3、人小胶质细胞系HMC3及原代正常人星形胶质细胞，分别建立静态Transwell单层(BEC monoculture)、双层(BEC+小胶质细胞)模型，以及微流控BBB-on-a-chip单层(BEC monoculture)、三层(tri-culture：BECs+星形胶质细胞+小胶质细胞)模型（上腔灌注剪切力4 dyn/cm²模拟毛细血管血流）。功能检测包括跨内皮电阻(transendothelial electrical resistance, TEER)、40 kDa FITC-葡聚糖(FITC-dex tran)通透性、免疫荧光定量闭锁蛋白(occludin)及 Claudin-5 表达与共定位(Jaccard index)、扫描/透射电镜、sEV摄取与miRNA cargo转移RT-qPCR、小胶质细胞IBA1及星形胶质细胞GFAP免疫荧光、IL-6 ELISA及划痕愈合(astrocyte migration)实验，数据统计采用Shapiro–Wilk正态性检验及t检验/ANOVA等。

研究结果

Increased concentration of circulating sEVs in PE（PE患者循环sEVs浓度升高）

通过差速超离心获sEVs组分，Western blot显示典型内吞途径标记物ALIX、CD63、TSG101富集，GAPDH低表达，PLAP-1阳性证实含胎盘来源sEVs；冷冻透射电镜(cryo-TEM)见典型脂质双膜囊泡形态。NTA显示PE组sEV粒径较NP组略大，颗粒浓度显著升高。qPCR示PE-sEVs中miR-141-3p及miR-519d-3p水平高于NP-sEVs，部分胎盘相关miRNA在PE-sEVs中差异表达，确认循环sEVs含胎盘来源并存在PE相关cargo改变。

sEVs from late-onset PE increase BEC barrier permeability by disrupting its structural integrity（晚发型PE-sEVs通过破坏BEC紧密连接结构完整性增加BBB通透性）

静态BEC单层模型予2 μg/mL sEVs或全血浆处理24 h，PE血浆及PE-sEVs显著降低TEER（分别为约0.70及0.65倍基线）并提高40 kDa FITC-葡聚糖通透（PE-sEVs组约2666 ng/mL vs 对照组约1303 ng/mL），效果与细胞因子混合阳性对照相当；NP-sEVs及NP血浆无显著影响。免疫荧光定量显示PE-sEVs使occludin及claudin-5平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)及二者共定位Jaccard index均显著低于未处理对照及NP-sEVs处理组，提示PE-sEVs通过下调紧密连接蛋白表达及共定位破坏BBB机械屏障。

Evidence of PE-sEV-associated signals across the BEC barrier and microglial activation（PE-sEV相关信号穿越BEC屏障及小胶质细胞激活的证据）

BEC上层加PKH67标记sEVs、下层共培养HMC3小胶质细胞，共聚焦见sEVs定位于BECs核周区提示细胞内摄取转运，且在腔面下侧小胶质细胞内检出PKH信号，表明sEV或cargo可跨越内皮层。直接/间接sEV处理的微胶质细胞中胎盘miRNA（尤以miR-519d-3p）水平升高，证明miRNA cargo转移；PE-sEVs使小胶质细胞IBA1⁺面积增大、形态向变形虫样(amoeboid)活化表型转变，NP-sEVs无此效应，说明PE-sEVs可激活小胶质细胞。

PE-sEVs impact the BBB in a dynamic organ-on-a-chip model（PE-sEVs在动态BBB-on-a-chip模型中影响BBB）

微流控芯片中BECs沿流场方向极化伸长，基础FITC-葡聚糖通透性低于静态模型。灌流24 h后PE-sEVs有增加通透趋势(P=0.0917)，免疫荧光示occludin及claudin-5 MFI显著下降（claudin-5在NP-sEVs组亦降低），Jaccard index变化不似静态模型显著；PKH标记sEVs见BECs内摄取，证实在仿生血流条件下PE-sEVs仍可内化并伴紧密连接蛋白减少。

A multicellular BBB-on-a-chip reveals astrocyte-driven IL-6 response to PE-sEVs（多细胞BBB-on-a-chip揭示星形胶质细胞主导PE-sEVs诱导的IL-6应答）

三层细胞芯片(BECs+星形胶质细胞+小胶质细胞)灌流50 μg/mL sEVs 24 h，PE-sEVs使上(内皮)室及下(胶质)室IL-6显著升高且下室更高(约1500–3000 pg/mL)；单培养证实BECs受sEV刺激分泌少量IL-6(约500–700 pg/mL)，而星形胶质细胞仅在PE-sEVs刺激下大量分泌IL-6(约2000–4000 pg/mL)，sEVs自身含极微量IL-6且组间无差异，表明PE-sEVs诱导的IL-6主要来自星形胶质细胞活化。

PE-sEVs promote a proinflammatory shift in astrocytes（PE-sEVs促使星形胶质细胞向促炎活化表型偏移）

原代星形胶质细胞经PE-sEVs处理后GFAP(glial fibrillary acidic protein)表达及整合密度升高，突起增厚回缩呈反应性星形胶质细胞形态；划痕实验示PE-sEVs处理8 h即加速gap闭合(达约50％覆盖率)，持续至24 h，NP-sEVs无此效应，提示PE-sEVs诱导星形胶质细胞反应性激活及迁移能力增强。

讨论与结论总结

研究人员讨论指出，本研究用人源静态及动态BBB-on-a-chip模型证明循环sEVs（部分胎盘来源）在PE中可降低BECs occludin/claudin-5表达与共定位致BBB通透性增加，sEVs或cargo可穿越内皮被小胶质细胞摄取并转移miRNA使之活化，同时在多细胞芯片中PE-sEVs引发星形胶质细胞主导的IL-6释放及GFAP上调、迁移增强，支持循环sEVs作为胎盘—脑轴介质参与PE母体BBB损伤与神经胶质激活。局限性包舍体外模型未完全复现PE全身炎症、血管生成失衡(sFlt-1等)及血流动力学波动，未涵盖大EV(lEVs)及sEV异质性、体内代谢动力学，需更复朵模型或体内实验验证。作者结论为：循环PE-sEVs在体外人源模型中损害BECs BBB相关特性并诱导神经胶质细胞促炎样反应，提示sEVs可能介导PE时外周循环与母体脑的交流并参与胎盘—脑轴相关的神经损伤，sEVs有潜力作为PE脑并发症生物标志物或治疗靶点，但结论基于具局限性的体外系统，需进一步体内验证。