《Cancer Research Communications》：MAGMAS knockdown in GBM cells increases sensitivity to TMZ, radiation, and ...
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胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM, 异柠檬酸脱氢酶野生型4级星形细胞瘤) 是最具侵袭性且最常见的脑肿瘤，其特征为高增殖性、侵袭性王小翔、线粒体依赖性改变及坏死。尽管采用最大范围手术切除、放疗及替莫唑胺(TMZ)的标准治疗方案，GBM复发仍不可避
胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM, 异柠檬酸脱氢酶野生型4级星形细胞瘤) 是最具侵袭性且最常见的脑肿瘤，其特征为高增殖性、侵袭性王小翔、线粒体依赖性改变及坏死。尽管采用最大范围手术切除、放疗及替莫唑胺(TMZ)的标准治疗方案，GBM复发仍不可避免。大多数患者在初次诊断后6至9个月内复发，且复发后中位生存期不足一年。因此，亟需有效的治疗策略以克服胶质瘤耐药机制并改善GBM患者的长期预后。线粒体相关粒细胞巨噬细胞集落刺激因子分子(Mitochondria-Associated Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor Molecule, MAGMAS, PAM16)是一种核编码的线粒体蛋白，为线粒体内膜转位酶23(Translocase of the Inner Membrane 23, TIM23)复合物的亚基，作为蛋白质向线粒体基质转运的关键调节因子发挥功能。研究人员此前已证实MAGMAS在GBM中过表达，且小分子MAGMAS抑制剂BT9可降低线粒体呼吸并对体外胶质瘤细胞产生细胞毒性。本研究中，研究人员探究了MAGMAS在GBM生物学中的作用以及MAGMAS抑制对TMZ耐药胶质瘤细胞系和患者源性胶质瘤干细胞样细胞(Glioma Stem-like Cell, GSC)的影响。研究人员观察到PAM16在复发性GBM、化疗耐药胶质瘤细胞及代谢转换过程中表达升高。BT9与TMZ联合处理在所有胶质瘤细胞系中均显著增加细胞死亡，且不受其TMZ耐药状态的影响。此外，稳定表达shPAM16的GBM细胞在体外及颅内异种移植模型中对TMZ的敏感性均增强。研究结果表明，靶向MAGMAS有望成为GBM的一种新型有效治疗策略。研究意义：该研究揭示了线粒体蛋白MAGMAS与胶质瘤中枢神经系统肿瘤化疗耐药之间的关联，有助于深化对线粒体在化疗耐药机制中重要作用的认识，并将MAGMAS突现为增强化疗耐药细胞中TMZ疗效的潜在靶点。
胶质母细胞瘤(Glioblastoma, GBM)是最常见且最具侵袭性的原发性脑肿瘤，5年总生存(Overall Survival, OS)率仅为7.2%。尽管诊断时可采用手术切除、放疗及替莫唑胺(TMZ)化疗等治疗手段，复发仍不可避免。TMZ是一种DNA烷化剂化疗药物，可甲基化DNA的嘌呤碱基(O6-鸟嘌呤、N7-鸟嘌呤和N3-腺嘌呤)。TMZ的细胞毒性活性通过O6-鸟嘌呤残基的甲基化介导，在DNA复制过程中，胸腺嘧啶而非胞嘧啶被掺入O6-鸟嘌呤对面的互补链，最终导致DNA损伤和双链断裂的累积，引发G2/M期细胞周期阻滞和凋亡。为应对TMZ诱导的DNA损伤，胶质瘤细胞上调DNA修复通路，如O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase, MGMT, 直接修复)，以及较不常见的碱基切除修复或DNA错配修复通路。MGMT启动子甲基化与GBM患者对TMZ的应答增加及生存改善相关。然而，近期临床研究证明MGMT作为生物标志物的价值有限，因其在预测新诊断患者生存方面的相对预后价值有限，且缺乏直接靶向方法。一项将TMZ与MGMT抑制剂(O6-苄基鸟嘌呤, O6-BG)联合用于复发性GBM的II期临床试验显示生存获益甚微，提示GBM中TMZ耐药可能存在其他机制。美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)最近批准用于GBM的治疗方案——肿瘤电场治疗(Tumor-Treating Fields, TTF, Optune)被证明可显著延长接受TTF联合TMZ维持治疗患者的总生存期，相较于单独TMZ治疗(20.9个月 vs. 16个月)。尽管目前有多种潜在新型疗法正在研究中，TMZ仍是该病的主要治疗药物，开发能与TMZ协同作用的联合疗法有待进一步探索。
线粒体通过多种机制在TMZ耐药发展中发挥关键作用，包括代谢重编程、凋亡调控、细胞增殖增加、线粒体生物发生及活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)产生的改变。研究人员已证明MAGMAS在GBM中过表达并在胶质瘤细胞存活中发挥关键作用。线粒体相关粒细胞巨噬细胞集落刺激因子分子(Mitochondria-Associated Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor Molecule, MAGMAS)在代谢活跃的组织(脑、骨骼肌和心肌)及其他癌症(包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和垂体腺瘤)中也存在过表达。MAGMAS是线粒体内膜转位酶23(Translocase of the Inner Membrane 23, TIM23)复合物的蛋白亚基，调节核编码线粒体蛋白向基质的导入。除在线粒体蛋白转运中的作用外，MAGMAS还被证明可通过调节ROS产生、增强抗氧化清除活性及改善电子传递链(Electron Transport Chain, ETC)复合物活性来提高细胞对氧化应激的耐受性。MAGMAS在调节细胞代谢和线粒体蛋白导入中的多重作用，使其抑制成为靶向GBM中线粒体介导耐药机制、改善GBM患者预后的一个引人注目的策略。
BT9是一种新型、可穿透血脑屏障的小分子MAGMAS抑制剂，研究人员此前报道其可显著诱导线粒体功能障碍、细胞内空泡形成和凋亡，并降低体外恶性胶质瘤和髓母细胞瘤系的增殖。此外，BT9在非中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)癌症(如卵巢癌、前列腺癌和乳腺癌)的体外研究中，显示对分化癌细胞具有细胞毒性。本研究中，研究人员探究了MAGMAS在GBM生物学中的作用及其在TMZ耐药中的参与。研究人员利用遗传学和药理学方法在体外胶质瘤模型和原位恶性胶质瘤异种移植小鼠模型中调控MAGMAS表达。
研究人员首先通过GlioVis数据库查询The Cancer Genome Atlas (TCGA)和中国脑胶质瘤基因组图谱(Chinese Glioma Genome Atlas, CGGA)的GBM患者数据集，比较IDH野生型原发性和复发性GBM样本中PAM16的表达，并进行相关性分析。
研究结果显示，MAGMAS水平在复发性GBM患者肿瘤标本和TMZ耐药胶质瘤细胞系中升高。通过CGGA和TCGA数据集比较，复发肿瘤中PAM16水平显著高于初治患者。PAM16与MGMT表达水平在原发GBM肿瘤标本中呈强正相关。在TMZ耐药细胞系(U-251 MG TR、OTR和D-54 MG TR、OTR)中，PAM16表达水平显著高于TMZ敏感亲本细胞系。TMZ处理3天后U-251 MG和T98G细胞中PAM16水平升高；DCA(丙酮酸脱氢酶激酶抑制剂)处理显著增加PAM14 mRNA表达和MAGMAS蛋白水平。U-251 MG、D-54 MG和T98G细胞在GSC培养基中培养30天后，PAM16表达升高，CD133+细胞比例增加，且对TMZ的耐药性增强。
MAGMAS的药理学抑制减少蛋白质向线粒体的转运。BT9(10 μmol/L)处理24小时后，线粒体裂解物中LONP1、COXIV、细胞色素C和ACO2蛋白水平降低。SILAC分析显示显著减少的蛋白参与有氧呼吸、三羧酸循环和细胞氨基酸分解代谢过程。BT9显著增加ROS产生，该效应可被抗氧化剂NAC部分淬灭。BT9使早期/晚期凋亡细胞增加30.7%，坏死细胞增加15.1%，而NAC联合处理可将凋亡和坏死分别降至13.6%和3.3%。在G12细胞中，BT9单独处理使活细胞降至25.9%，TMZ单独处理降至38.1%，而联合处理仅11.5%活细胞。
BT9对TMZ耐药胶质瘤细胞系和GSC有效，且对正常人星形胶质细胞(HA)毒性有限。BT9在TMZ耐药系(TR和OTR)中的IC50与亲本TMZ敏感系相似(2.97-6.27 μmol/L)，表明BT9可靶向任何TMZ耐药状态的细胞。患者源性GSC系DB93和Mayo Clinic脑肿瘤PDX系G12、G85对BT9敏感(IC50: 1.69-3.25 μmol/L)，而正常HA的IC50>8 μmol/L，提示良好的治疗指数。
BT9联合TMZ对GSC和TMZ耐药胶质瘤细胞具有协同或相加效应。SynFinder+分析显示，DB93和T98G的HSA协同得分最高(>10，协同)，其他细胞系在-10至+10之间(相加)。G12-Luc原位移植模型中，BT9单独处理与载体相比无显著生存差异，TMZ单独显著延长生存，而BT9+TMZ联合较TMZ单独有延长生存的趋势(P=0.0790)，且有一只小鼠未出现健康恶化或肿瘤生长征象。
MAGMAS敲低增强GBM细胞对TMZ、放疗和肿瘤电场治疗的敏感性。通过慢病毒shRNA建立PAM16敲低系，经Western blot验证。PAM16敲低使U-251 MG、T98G、G12和HOG细胞中MGMT表达显著降低，NRF1蛋白水平降低。PAM16敲低使U-251 MG和HOG对TMZ诱导的细胞死亡敏感化，U-251 MG、T98G和G12敲低细胞ROS水平显著增加。克隆形成实验显示敲低细胞克隆形成能力降低。辐射处理(0-6 Gy)后，PAM16敲低U-251 MG和T98G细胞克隆形成呈剂量依赖性减少，2 Gy和6 Gy时最显著。200 Hz TTF处理3天后，PAM16敲低U-251 MG和T98G细胞对TTF诱导的细胞死亡更敏感。G12-Luc原位模型中，Sh1+TMZ组小鼠在研究期间全程存活，无健康恶化或肿瘤征象，显著优于Scramble+TMZ组(P=0.0018)和Sh1+载体组(P=0.0021)。HOG模型中，Sh1+TMZ组中位生存>150天，显著优于Sh1+载体(P=0.0002)。
讨论部分，研究人员指出GBM是侵袭性最强的CNS癌症之一，目前标准治疗仅能适度延长患者生命，大多数肿瘤在初次诊断后第一年内复发。耐药机制涉及肿瘤异质性、免疫抑制性肿瘤微环境、GSC、线粒体重编程及DNA修复通路激活等。本研究发现MAGMAS在复发性GBM、TMZ耐药系和GSC中过表达，且PAM16与MGMT表达正相关，提示其参与线粒体介导的TMZ耐药机制。MAGMAS通过调节DNAJC19的ATP酶刺激活性调控线粒体基质蛋白转运，并作为ROS调节因子发挥作用。耐药细胞从有氧糖酵解转向氧化磷酸化(OXPHOS)产生ATP，而MAGMAS过表达可能通过促进线粒体蛋白转运、减少ROS产生和增强ETC活性来促进这一代谢转变。
CD133(PROM1)是广泛用于鉴定包括GBM在内的多种癌症干细胞的表面标志物，调节与化疗耐药、静止、肿瘤复发、异质性和细胞分化相关的多种必需通路。本研究中，在去分化获得TMZ耐药过程中观察到PAM16和CD133表达显著升高。亚致死剂量TMZ暴露增强线粒体功能，增加氧消耗，而MAGMAS水平升高有助于通过增加蛋白转运能力将蛋白带入线粒体基质，缓解线粒体功能障碍。BT9抑制MAGMAS减少线粒体靶向蛋白的导入，增加超氧化物水平，从而促进ROS产生和细胞凋亡。BT9与TMZ联合在所有测试胶质瘤细胞系中均表现协同或相加效应，体内联合治疗也延长总生存期，支持其用于原发和复发肿瘤的临床潜力。
MAGMAS敲低使U-251 MG、T98G、G12和HOG细胞对TMZ、放疗和TTF更敏感。G12-Luc和HOG PAM16敲低原位模型中，联合TMZ显著延长生存，尤其是GSC对MAGMAS破坏更为敏感。这些发现提示MAGMAS抑制联合现有治疗可能具有未来临床相关性。
研究结论指出，大多数GBM患者在治疗后一年内复发，由于化疗和放疗耐药，临床治疗方案有限。为开发可与标准治疗联合使用的新型治疗化合物，有必要了解细胞心力衰竭暴露后急性和晚期耐药阶段触发的细胞反应机制。研究结果表明，MAGMAS在化疗耐药中发挥重要作用，其抑制通过联合处理使耐药细胞对TMZ敏感。抑制MAGMAS可抑制LONP1、ACO2、COXIV和细胞色素C等必需核编码蛋白向线粒体的转运，这些蛋白对维持线粒体稳态和氧化磷酸化能量代谢至关重要。LONP1是多种癌症中高表达且与预后不良相关的必需线粒体蛋白。减少LONP1水平进一步增加线粒体应激、ROS积累和生物能量受损。此外，抑制该通路增加蛋白水解应激并降低能量代谢，使细胞对TMZ的杀伤力更为脆弱。需要进一步研究阐明MAGMAS的作用机制。总之，通过抑制MAGMAS进而抑制线粒体蛋白转运来破坏线粒体稳态，可能恢复TMZ耐药GBM对TMZ的敏感性，从而为改善GBM患者预后提供潜在治疗策略。
