抑制MAGMAS可增强替莫唑胺对化疗耐药胶质母细胞瘤模型的治疗效力

《Cancer Research Communications》：MAGMAS Inhibition Enhances Temozolomide Efficacy in Chemotherapy-Resistant Glioblastoma Models Open Access

　　

胶质母细胞瘤（GBM，异柠檬酸脱氢酶野生型4级星形细胞瘤）是侵袭性最强且最常见的脑肿瘤，其特征为增殖增强、侵袭性升高、线粒体依赖性改变以及坏死。尽管标准治疗包括最大范围手术切除、放疗和替莫唑胺（TMZ），GBM仍几乎普遍复发。多数患者在初次诊断后6至9个月内复发，复发后的中位生存期不足1年。因此，亟需有效治疗策略以克服胶质瘤耐药机制并改善GBM患者的长期结局。粒-巨噬细胞集落刺激因子相关线粒体分子（MAGMAS，PAM16）是一种核编码的线粒体蛋白，是线粒体内膜转位酶23复合体的亚基，其功能是作为蛋白转运进入线粒体基质的关键调控因子。既往研究已证实，MAGMAS在GBM中过表达，且小分子MAGMAS抑制剂BT9可降低线粒体呼吸并在体外对胶质瘤细胞产生细胞毒性。本研究考察了MAGMAS在GBM生物学中的作用，以及抑制MAGMAS对TMZ耐药胶质瘤细胞系和患者来源胶质瘤干样细胞的影响。研究人员观察到，在复发性GBM、化疗耐药胶质瘤细胞以及代谢转换过程中，PAM16水平均升高。与任一单药相比，BT9与TMZ联合处理在所有胶质瘤细胞系中均显著增加细胞死亡，且不受其TMZ耐药状态影响。此外，组成型表达shPAM16的GBM细胞在体外及颅内异种移植模型中均对TMZ更加敏感。研究结果提示，靶向MAGMAS有望成为GBM一种新的且有效的治疗策略。意义：本研究发现了线粒体蛋白MAGMAS与胶质瘤中枢神经系统癌症化疗耐药之间的关联。这些发现有助于深化对线粒体在化疗耐药机制中关键作用的理解，并提示MAGMAS可作为提高TMZ在化疗耐药细胞中疗效的潜在靶点。

该论文发表于《Cancer Research Communications》，围绕胶质母细胞瘤（GBM）的化疗耐药问题展开，核心关注线粒体相关蛋白MAGMAS在替莫唑胺（TMZ）耐药中的作用及其治疗学价值。GBM是中枢神经系统中恶性程度最高的原发性脑肿瘤之一，标准治疗虽包括最大范围切除、放疗及TMZ化疗，但复发几乎不可避免。现有研究表明，TMZ耐药并非仅由O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT，直接修复DNA损伤的关键酶）驱动，还涉及肿瘤异质性、胶质瘤干样细胞（GSC，具有自我更新和促复发能力的细胞群）、DNA损伤修复通路激活以及线粒体代谢重编程等多重机制。因此，寻找可与TMZ联用、并能干预耐药关键环节的新靶点，具有明确的临床必要性。研究人员此前已发现MAGMAS在GBM中过表达，并且小分子抑制剂BT9可损伤线粒体功能、抑制胶质瘤细胞生长。本研究进一步系统评估了MAGMAS在复发GBM、TMZ耐药细胞和GSC状态中的表达特征，并检验药理学或遗传学抑制MAGMAS是否能恢复肿瘤细胞对TMZ及其他治疗的敏感性。研究最终得出结论：MAGMAS与GBM化疗耐药密切相关，抑制MAGMAS可通过破坏线粒体蛋白转运与稳态、提高氧化应激和细胞死亡，从而增强TMZ疗效，并在体内外模型中延长生存，提示MAGMAS是一项具有潜在转化价值的治疗靶点。

为完成上述研究，研究人员主要采用了几类关键技术方法。首先，结合CGGA和TCGA数据库对原发与复发IDH野生型GBM样本进行PAM16表达分析，并进行与MGMT的相关性分析。其次，使用既有TMZ敏感与耐药胶质瘤细胞系、患者来源细胞DB93，以及Mayo Clinic来源的患者来源异种移植（PDX）细胞G12和G85，开展qPCR、Western blot、细胞活力检测、流式细胞术、活性氧（ROS）测定和凋亡分析。再次，通过GSC培养条件诱导去分化模型评估干性富集状态下的PAM16变化，并利用shRNA构建PAM16敲低细胞。最后，在NSG小鼠颅内原位异种移植模型中评估BT9和TMZ联用或PAM16敲低联合TMZ对肿瘤生长与总生存期（OS）的影响。

在结果部分，论文首先给出了“MAGMAS levels are increased in recurrent GBM patient tumor specimens and TMZ-resistant glioma cell lines”。研究人员通过CGGA和TCGA数据发现，复发性GBM中PAM16表达高于新诊断GBM，且PAM16与MGMT在原发GBM样本中呈正相关。进一步在U-251 MG和D-54 MG的TMZ耐药亚系中检测到，TR与OTR细胞的PAM16表达均高于亲本敏感细胞。短期TMZ暴露和二氯乙酸钠（DCA）诱导代谢转换均可上调PAM16，而在GSC培养条件下去分化的U-251 MG、D-54 MG和T98G细胞中，PAM16亦随时间升高，并伴随CD133阳性细胞增加及TMZ敏感性下降。该部分说明MAGMAS与复发、耐药和干样表型富集密切相关。

第二个结果小标题为“Pharmacologic inhibition of MAGMAS decreases protein trafficking into the mitochondria”。研究人员使用BT9处理U-251 MG、D-54 MG和G12细胞后发现，多种进入线粒体并参与线粒体稳态与氧化磷酸化（OXPHOS，氧化磷酸化供能过程）的蛋白，如LONP1、COXIV、cytochrome c和ACO2在线粒体组分中减少，提示MAGMAS抑制削弱了核编码线粒体蛋白向线粒体内的转运。SILAC分析进一步显示，下调蛋白主要涉及有氧呼吸、三羧酸循环及氨基酸分解代谢。与此同时，BT9增加线粒体ROS，抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）可部分逆转该效应，并减少BT9诱导的早晚期凋亡和坏死。这说明MAGMAS抑制后，线粒体蛋白转运障碍与氧化应激升高共同参与胶质瘤细胞死亡。

第三个结果小标题为“BT9 is effective against TMZ-resistant glioma lines and GSC and has limited toxicity against HAs”。研究人员在TMZ敏感和耐药胶质瘤细胞、患者来源GSC/PDX细胞中评估BT9细胞毒性，发现BT9对亲本细胞与TR、OTR耐药细胞均表现出相近的抑制作用，说明其作用并不受TMZ耐药状态限制。患者来源DB93、G12和G85同样对BT9敏感，而正常人星形胶质细胞（HA）的IC₅₀高于肿瘤细胞，提示BT9具有一定治疗窗口。这一结果表明MAGMAS抑制可能适用于多种GBM耐药背景。

第四个结果小标题为“MAGMAS inhibition with BT9 sensitizes GSC and TMZ-resistant glioma cells to TMZ”。研究人员将BT9与TMZ联用于多种胶质瘤细胞和GSC，结果显示联合处理较任一单药更明显降低细胞活力。基于HSA模型的联合评分显示，部分细胞系达到协同，其余多为加和效应，但总体均提示BT9能够增强TMZ杀伤作用。进一步在G12-Luc原位移植模型中，TMZ较对照显著延长生存，而BT9联合TMZ较TMZ单药呈现进一步获益趋势，并有个别动物无明显肿瘤进展迹象。该部分支持MAGMAS药理抑制可增强TMZ体内外疗效。

第五个结果小标题为“MAGMAS knockdown in GBM cells increases sensitivity to TMZ, radiation, and TTFs”。为验证药物结果，研究人员构建了U-251 MG、T98G、G12和HOG的PAM16敲低模型。敲低后，MGMT mRNA下降，部分细胞中MGMT蛋白亦减少，同时NRF1水平降低，提示MAGMAS可能与调控TMZ反应相关通路存在联系。功能上，PAM16敲低提高了U-251 MG和HOG对TMZ的敏感性，并在U-251 MG、T98G和G12中提升ROS水平、降低克隆形成能力。进一步接受0–6 Gy放疗或200 Hz肿瘤电场治疗（TTFs）后，PAM16敲低细胞较对照表现出更高敏感性，说明MAGMAS不仅关联化疗反应，也影响放疗和TTFs疗效。

第六个结果小标题为“MAGMAS knockdown in combination with TMZ increases OS in an orthotopic glioma mouse model”。研究人员将G12-Luc-Scramble和G12-Luc-Sh1细胞分别颅内接种于NSG小鼠。结果显示，Scramble+TMZ较Scramble+vehicle显著延长生存，而Sh1+vehicle也优于Scramble+vehicle。最显著的是Sh1+TMZ组，在整个观察期内均未出现明显健康恶化或可检测肿瘤，显示PAM16敲低与TMZ联用具有最强体内抗肿瘤效应。HOG原位模型中，Sh1+TMZ同样显著改善生存，进一步证明干预MAGMAS可在体内增强TMZ治疗效果。

讨论部分强调，GBM耐药是多因素驱动的复杂过程，线粒体代谢重编程是其中的重要维度。本文证实MAGMAS在复发GBM、TMZ耐药细胞和GSC状态中持续升高，并与MGMT呈正相关，提示其可能参与线粒体介导的耐药形成。随着肿瘤细胞经历由糖酵解向OXPHOS的代谢转换，对线粒体蛋白输入与稳态维持的需求增强，而MAGMAS作为TIM23复合体相关蛋白，可通过促进蛋白转运、缓解ROS毒性和维持电子传递链功能来支持这一适应过程。BT9或shPAM16所造成的MAGMAS抑制，则削弱线粒体蛋白输入能力，降低LONP1、ACO2、COXIV和cytochrome c等关键蛋白水平，增加ROS负荷与蛋白毒性应激，进而使肿瘤细胞更易受到TMZ、放疗和TTFs打击。文章据此认为，MAGMAS是连接线粒体稳态、代谢适应和治疗耐受的重要节点，靶向该分子具有提高现有标准治疗效力的潜力。

研究结论部分可译为：多数GBM患者在治疗后1年内出现肿瘤复发，并因对化疗和放疗产生耐受而缺乏有效临床治疗选择。为开发可与标准治疗联合应用的新型治疗化合物，有必要阐明细胞在暴露于化疗后急性期与晚期耐药阶段被触发的应答机制。研究结果提示，MAGMAS在化疗耐药中发挥重要作用，对其进行抑制可通过联合治疗使耐药细胞对TMZ重新敏感。通过抑制MAGMAS，可抑制包括LONP1、ACO2、COXIV和cytochrome c在内的关键核编码蛋白向线粒体转运。这些关键蛋白有助于维持线粒体稳态及OXPHOS能量代谢。该通路受抑还会增加蛋白水解应激并降低能量代谢，使细胞更易受TMZ作用。总体而言，本研究表明，通过抑制MAGMAS并继而破坏线粒体蛋白转运、扰乱线粒体稳态，可能恢复TMZ耐药GBM对TMZ的敏感性，从而为改善GBM患者预后提供一种潜在治疗策略。