《The Plant Genome》：Genome-wide association study identifies genomic regions under selection for domestication and agronomic traits in intermediate wheatgrass
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摘要：中间偃麦草（Intermediate wheatgrass, IWG; Thinopyrum intermedium，商品名Kernza）是一种多年生牧草，目前正作为谷类作物进行新驯化（neo-domestication）。IWG可提供多种生态系统服务，
摘要：中间偃麦草（Intermediate wheatgrass, IWG; Thinopyrum intermedium，商品名Kernza）是一种多年生牧草，目前正作为谷类作物进行新驯化（neo-domestication）。IWG可提供多种生态系统服务，并作为具有高市场价值的替代作物选项，有潜力惠及农村社区。然而，IWG作为多年生谷类专业作物仅经历了数十年的改良，明尼苏达大学（University of Minnesota, UMN）自2011年才启动其育种工作。为使IWG成为美国中西部可持续谷类专业作物，尚需对其籽粒相关性状、市场开发及农艺管理进行改良。本研究选取UMN IWG育种第2、3、4、5轮回中的225份基因型独特无性系单株（genets），进行克隆繁殖后于两个地点连续评价2年。研究人员采用基因型测序（genotyping-by-sequencing, GBS）获得12,072个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）标记，并对关键驯化及农艺性状进行表型鉴定。全基因组关联分析（genome-wide association study, GWAS）共鉴定到与落粒性（shattering）、种子大小及产量性状相关的36个数量性状位点（quantitative trait locus, QTL），单个QTL平均解释表型变异（phenotypic variance explained, PVE）的13%。若干QTL定位至此前在IWG及其他禾谷类作物中已报道的同源染色体或同源区域。研究人员进一步检测显著QTL等位基因频率在育种轮回间的变化，鉴定出12个受选择（under selection）的等位基因。部分有利等位基因仍以低频（minor frequency）存在，表明该物种具有持续遗传改良的巨大潜力。将GWAS显著关联位点作为固定效应纳入基因组选择（genomic selection, GS）模型，可支持实施轮回选择方案，以策略性提高有利等位基因频率并聚合正向性状，实现长期遗传增益。
论文解读：
本研究发表于《The Plant Genome》。多年生禾本科作物替代传统一年生作物有助于缓解土壤退化、养分流失及生物多样性下降等农业生态环境问题。中间偃麦草（Intermediate wheatgrass, IWG; Thinopyrum intermedium，Kernza）为异交型六倍体（2n=6x=42，基因组约12.75 Gb）多年生牧草，正经历新驯化过程，但其籽粒产量、种子大小、抗落粒性等关键驯化与农艺性状仍待改良。此前UMN IWG育种项目已观测到表型值增益，但关键性状对应的等位基因频率变化与育种选择的关系尚未阐明，且既往关联分析多基于双亲群体或单一轮回，未能全面反映育种群体中等位基因多样性。为此，研究人员利用来自UMN第2～5育种轮回的亲本基因线（genets，基因型独特个体）开展全基因组关联分析（genome-wide association study, GWAS）及育种轮回等位基因频率动态监测，旨在解析驯化与农艺性状的遗传架构及人工选择信号，为新驯化作基因组指导。
主要关键技术方法：研究材料为UMN IWG育种第2、3、4、5轮回共225份genets（原始242份克隆，移栽后存活225份），经营养繁殖后于明尼苏达州圣保罗和兰伯顿两地点、2021与2022年两年度种植评价。性状测定涵盖株高、开花期、10穗干重、小穗密度、脆轴落粒（brittle rachis shattering）、小花落粒（floret shattering）、脱壳性（threshability）、千粒重（1000-grain weight, TGW）及种子面积/长/宽/长宽比；落粒性状以10穗籽粒重为协变量校正。基因型采用GBS（PstI/MspI酶切）建库Illumina NovaSeq 6000测序，比对至Thinopyrum intermedium v3.1参考基因组，严格质控过滤及LD-kNNi法填充后保留12,072个双等位SNP。表型数据用线性混合模型计算最佳线性无偏估计值（best linear unbiased estimate, BLUE）及广义遗传力（broad-sense heritability, H2）。GWAS采用FarmCPU模型（GAPIT软件包），Bonferroni校正显著性阈值p<4.14×10?6，并估算表型方差解释率（percent phenotypic variance explained, PVE）。显著SNP等位基因频率按育种轮回分别计算，用二项广义线性模型检验轮回间有利等位基因频率变化趋势，判定受选择位点。显著关联区域以连锁不平衡（linkage disequilibrium, LD）半衰减距离（0.78 Mbp）界定QTL，并与参考基因组注释取交集，BLASTP比对小麦、大麦、水稻蛋白库以注释候选基因。
研究结果：
3.1 SNP discovery pipeline and linkage disequilibrium
经过质控和填充保留12,072个SNP，全基因组LD半衰减距离为0.78 Mbp，以此作为界定QTL的窗口。
3.2 Brittle rachis, floret, and average shattering
脆轴落粒（H2=0.73）、小花落粒（H2=0.70）及平均落粒（H2=0.64）广义遗传力较高。鉴定到脆轴落粒QTL 3个（染色体J02、S02、S07，PVE 10.5%–11.6%），小花落粒QTL 5个（S02、S06、V02，PVE 11.0%–14.2%），平均落粒QTL 3个（S04、S05、V04，PVE 11.7%–18.3%）。11个落粒QTL中5个在育种轮回间有利等位基因频率呈显著变化，其中3个（小花落粒及脆轴落粒）频率显著上升，2个（平均落粒S05、小花落粒S06）显著下降——下降者初始均为次要等位基因（minor allele）。
3.3 Seed size
种子大小性状广义遗传力中等偏高（TGW H2=0.53，种子长宽比H2=0.75）。共鉴定种子大小相关QTL 14个：种子面积4个（J03、J04、S03，PVE 11.0%–13.0%，其中S03与TGW共享），种子宽度3个（J05、S01、V07，PVE 12.7%–18.0%），种子长度7个（J03、J04、S01、S03、S05、V02、V07，PVE 10.8%–15.7%，其中J03与种子面积共享）。若干种子大小有利等位基因频率在轮回间显著上升（S03种子面积/TGW位点，J04及S03种子长度位点），显示受正向选择。
3.4 TGW, spikelet density, and 10-spike seed and spike weight
TGW（S01、S03，PVE 12.8%–14.3%）、小穗密度（J07、S02、S05、S07、V02共6个QTL，PVE 11.2%–19.5%）、10穗干重（J02，PVE 11.1%）及10穗籽粒重（J02、S04、S07、V02共4个QTL，PVE 10.5%–12.9%）分别被检测到。轮回间小穗密度2个QTL（S02、S07）及10穗籽粒重1个QTL（V02）有利等位基因频率显著上升，但10穗籽粒重S04位点有利等位基因频率显著下降。36个QTL中共12个（33%）显示显著等位基因频率趋势——9个（75%）有利等位基因频率显著上升（正向选择），3个显著下降；其余24个无显著线性趋势。多数有利等位基因在各轮回中以次要等位基因（MAF≤0.5）存在。
3.5 Comparison of identified QTLs to domesticated species and other IWG studies
将显著关联区间基因模型与小麦、大麦、水稻蛋白库比对，筛选出＞200个高置信度同源基因，重点候选基因包括：脆轴落粒相关9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED6）、LOB结构域转录因子、木葡聚糖内转葡萄糖苷酶/水解酶（XTH）；小花落粒相关内切葡聚糖酶5（Endoglucanase 5）及CASP-like蛋白；种子宽度相关苯丙氨酸解氨酶（PAL）；种子长度相关蔗糖磷酸合成酶（SPS）、AP2/ERF转录因子、富含亮氨酸重复受体样激酶（LRR-RLK）；籽粒重/面积相关组氨酸激酶（细胞分裂素受体）；10穗籽粒重相关生长素响应因子（ARF）、钾转运蛋白及染色质重塑蛋白CHR5。部分QTL定位于与其他IWG研究及禾谷类驯化基因（如大麦Btr1/Btr2、小麦Q基因同源区）相同的同源群或染色体。
讨论部分总结：
本研究全基因组LD快速衰减（0.78 Mbp）符合IWG异交特性，利于精细定位。严格Bonferroni阈值下鉴定36个QTL，单个PVE偏高可能与群体规模（n=225）适中有关，但性状本身属多基因控制。落粒性状由独立遗传架构控制——脆轴落粒与小花落粒遗传分化，无共享QTL，与既往结论一致；S02染色体上内切葡聚糖酶5同源基因暗示保守的非落粒演化机制。部分落粒有利等位基因频率下降系因其为稀有次要等位基因且在多性状综合选择中未被优先保留。种子大小与产量受碳同化分配（PAL、SPS）、细胞增殖与伸长调控（AP2/ERF、LRR-RLK、细胞分裂素受体）及同化物转运（钾转运蛋白）、激素信号（ARF）和表观重塑（CHR5）共同调控。育种轮回中等位基因频率变化显示多数有利等位基因尚未被固定，仍以次要等位基因存在，具进一步聚合改良空间。将本研究中PVE＞10%的主要QTL作为固定效应纳入基因组选择（genomic selection, GS）模型可提升预测准确性，结合GWAS命中位点的轮回选择可有策略性地提高有利等位基因频率并聚合优异性状，推动IWG新驯化进程。
