发现小麦种质资源中 putative novel（推定新型）茎锈病（stem rust, SR）抗性位点

《The Plant Genome》：Discovering putative novel stem rust resistance loci in wheat genetic resources

　　

茎锈病（stem rust, SR）由小麦条锈菌（Puccinia graminis f. sp. tritici, Pgt）引起，对德国小麦生产构成威胁。本研究在四个田间环境下评估了200份植物种质资源（plant genetic resources, PGR）和50份精英品系。基于PGR材料开展多环境全基因组关联分析（genome-wide association study, GWAS），共获得1942个标记-性状关联（marker-trait association, MTA），归为8个数量性状位点（quantitative trait locus, QTL），各自解释0.84%–28.19%的表型方差。其中三个QTL（QSr1B_1.47_67.79、QSr4A_716.31_716.32和QSr7D_171.80_174.34）包含五个单倍型，可能在育种中尚未被利用。五个代表性MTA（Chr1B:25506861、Chr1B:17349639、Chr1B:67755088、Chr4A:716319007和Chr7D:171807054）代表这五个推定新型单倍型，共同保守解释2.40%–7.03%的表型方差。研究人员鉴定出四个携带所有有利等位基因的基因型，可作为未来育种的潜在供体系。在八个QTL区域内优先筛选出44个候选基因。这些发现为SR抗性的遗传架构提供了新见解，并为标记辅助预育种（marker-assisted prebreeding）指明了有前景的目标。

研究背景：茎锈病（SR）由Puccinia graminis f. sp. tritici（Pgt）引起，是小麦（Triticum aestivum L.）最具破坏性的病害之一，可在全球范围内造成严重产量损失。尽管SR曾在德国消失数十年，但2013年重新出现在五个联邦州，促使相关研究重新受到关注。目前德国小麦种质中主要抗性基因Sr24、Sr31和Sr38/Yr17仍有效，但尚未在本地品种中发现新的主要抗性位点；且高度毒性Pgt小种（如TTKST、TKKTP）可克服Sr24和Sr38/Yr17，凸显出现有抗性部署策略的关键缺口。绝大多数SR抗性基因为小种专化全生育期抗性（all-stage resistance, ASR），持久性有限；虽已报道超过300个SR相关数量性状位点（QTL），但多数并非独特或未被充分挖掘。欧洲精英小麦育种池的SR抗性遗传基础亟需拓宽，而从德国联邦非原生境基因库（由Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, IPK运营）保存的植物种质资源（PGR）中是发现新型SR抗性等位基因的重要未充分开发库。此前针对黄锈病（Puccinia striiformis f. sp. tritici）和叶锈病（Puccinia triticina）的靶向筛选已成功构建性状定制核心收集（trait-customized core collection, T3C）群体，但T3C在识别新型SR抗性等位基因方面的潜力尚未探索。本研究以T3C预筛选为基础，利用194份冬小麦遗传资源开展多环境全基因组关联分析（GWAS），目标是：（i）鉴定与SR抗性相关的基因组位点；（ii）评估PGR发现精英育种计划中未利用的新型抗性来源的潜力；（iii）在QTL基因组区间内优先筛选高置信度候选基因。论文发表在《The Plant Genome》。

主要关键技术方法：研究人员采用性状定制核心收集（T3C）群体（源自IPK德国联邦非原生境基因库的冬小麦收集，基于以往田间黄锈病、叶锈病和白粉病抗性分子与表型多样性筛选出的200份PGR和50份精英品系），在四个田间环境（Dahlem 2023、Silstedt 2023、Silstedt 2024、Hohenheim 2024）进行人工接种混合Pgt小种的抗性评估，表型以秆段覆锈面积百分比转为1–9级记录，取最大值为最终严重度；利用全基因组重测序（whole-genome resequencing, WGS）获得SNP数据并经质控过滤（MAF≥0.05等）后，用PLINK、VCFtools、BCFtools等进行基因型管理，BEAGLE填补缺失数据；群体结构分析采用邻接树（VCF2Dis、iTOL）、连锁不平衡（LD, r²）衰减（PopLDdecay）、核苷酸多样性（π, VCFtools）；Pgt样本亦经WGS测序与变异检测，进行聚类（K-means、UPGMA）与遗传结构分析；关联分析采用多环境GWAS模型，检测标记加性主效应、标记×环境互作（SNP×E）及环境特异性效应，方差分量通过P3D（群体参数预先确定）法一次估计并固定，显著性阈值经Bonferroni校正；QTL归群基于PLINK clump按LD（r²>0.3）与50 Mbp窗口分组；新位点判定标准为精英组中至少90% SNPs的有利等位基因频率（favorable allele frequency, FAF）≤0.05；表型方差解释率（PVE）由线性回归估计；候选基因取自中国春参考基因组v2.1，功能注释来自eggNOG-mapper和Triticeae-Gene Tribe，NLR基因集按NB-ARC与LRR域界定，变异注释用ANNOVAR。

研究结果：

3.1 小麦群体底层分子多样性（Molecular diversity of the underlying wheat population）：研究人员对243份一致性基因型（194份PGR、49份精英）进行WGS并获得高质量SNP（PGR：24,323,883个；精英：9,384,031个）。系统发育邻接树显示精英系与PGR大体分簇但仍有一些例外（源于欧洲共同起源）。LD衰减在PGR中快于精英组，核苷酸多样性（π）在多数染色体上PGR更高，证实PGR群体遗传多样性更丰富。

3.2 尽管人工接种仍存基因型-环境互作（Genotype-environment interactions persisted despite controlled inoculation）：四个环境下SR严重度均产生显著基因型方差（p<0.001），组内遗传力≥0.6；跨环境广义遗传力精英为0.88、PGR为0.77。G×E互作方差分量显著大于零（p<0.001），环境间及基因型间互作热图未出现明显环境簇或精英/PGR分组差异。对2023年采集的Pgt样本WGS（平均16×）分析获76,026个双等位多态SNP，聚类确定最优簇数k=4（轮廓法）或3（肘部与间隙统计量），但遗传簇与采样地点不吻合（各簇含≥两个地点样本），说明局部pedoclimatic条件未导致接种物遗传组成明显分化，G×E更可能由温度等环境因子与小麦基因型互作（如温度敏感免疫基因Sr6、Sr13、Sr21）引起。

3.3 PGR组的SR胁迫响应全基因组关联分析（Genome-wide association analyses for SR stress responses in the PGR group）：多环境GWAS在PGR上共检出637个显著主效应MTA（染色体1B：635个；4A：2个；-log₁₀(p)≥8.69），无MTA显示显著环境互作；另检出22个显著SNP×E效应（1B：3个；4B：19个），其中5个对应单环境MTA。单环境分析新增1291个MTA，总计1942个。按LD（r²≥0.3）归为8个QTL（分布于1B、1D、4A、4B、5A、7D）；QSr1B_88.99_178.52在两环境与主效应中稳定检出；一个QTL具显著QTL×E互作；QSr4A_716.31_716.32仅主效应检出。各QTL领军SNP解释表型方差：主效应分析2.29%–13.30%，单环境0.84%–28.19%（Silstedt2023多数QTL解释12.09%–23.82%）；QSr1B_1.47_67.79、QSr1B_88.99_178.52、QSr1B_178.54_222.33在各环境解释比例最高。

3.4 从PGR中鉴定SR新型抗性位点（Identification of novel resistant loci for SR from PGR）：比较1942个MTA在PGR与精英组的有利等位基因频率（FAF），精英FAF范围0–0.49，PGR为0.06–0.61；328个MTA在精英FAF≤0.05（88个FAF=0），但因与MTA处于高LD（r²≥0.6）内的非显著SNP可能在精英并不罕见，故将所有SNP（含非显著）按LD≥0.6聚类为39个簇（每簇至少1个MTA，以最显著MTA为代表MTA）。五簇满足≥90% SNPs在精英FAF≤0.05，判为推定新型：Cluster1B:17349639（QTL QSr1B_1.47_67.79，代表MTA Chr1B:17349639，PGR FAF=0.21，精英FAF=0），Cluster1B:25506861（同QTL，代表Chr1B:25506861，PGR FAF=0.14，精英FAF=0），Cluster1B:66709855（同QTL，代表Chr1B:66709855，PGR FAF=0.11，精英FAF=0），Cluster4A:716319007（QTL QSr4A_716.31_716.32，代表Chr4A:716319007，PGR FAF=0.09，精英FAF=0.02），Cluster7D:171807054（QTL QSr7D_171.80_174.34，代表Chr7D:171807054，PGR FAF=0.10，精英FAF=0.02）。QSr1B_1.47_67.79的LD结构复杂，领军SNP（精英FAF=0.18）不能代表新型，其内273个精英FAF<0.05的MTA归21簇仅3簇新型；其余两QTL（4A、7D）LD结构简单各含1簇且皆为新型。五个代表MTA各自附加PVE较小（主效应0.01%–1.14%，各环境0.01%–2.96%），但五者合计解释2.40%–7.03%表型方差；携带有利等位基因的材料抗性显著更好（Student t检验）；从中选出四份PGR基因型同时具五个有利等位基因，可作未来育种的潜在供体。

讨论部分总结：研究人员指出，近期欧洲SR疫情因变暖加剧风险，需发掘新抗性源；尽管统一人工接种混合Pgt小种，仍检测到显著G×E互作（方差分量p<0.001），各QTL解释率环境间波动大（如QSr4B_413.24_425.52在Dahlem2023为3.73%、Silstedt2023为18.81%），Pgt种群遗传结构分析未显示地点间分化，故G×E更可能来自温度、干旱等pedoclimatic因子与小麦基因型互作（如温度敏感抗性基因Sr6、Sr13、Sr21），建议结合环境数据与小区水平Pgt测序以深入理解。八个位点中五个与既往报道重叠（如QSr1B_1.47_67.79共定位已知Sr31位点，解释率高且与中欧近年QTL映射一致，该区域复杂，存在1BL.1RS易位与替代型等），三个为新（QSr7D_171.80_174.34远于既往7D QTL；QSr1D_422.96_428.55与QSr4B_413.24_425.52邻近已知但无重叠，因LD复杂需后续验证）。候选基因分析在QSr1B_1.47_67.79内找到NLR基因TraesCS1B03G0068600（含MTA Chr1B:17349639，即新型簇Cluster1B:17349639），该QTL高LD区块内有TraesCS1B03G0196800等三基因；QSr4A_716.31_716.32内筛得TraesCS4A03G1083100等抗病相关基因；其余QTL未获导致蛋白改变的变异候选。最后研究人员强调，本研究挖掘精英缺失新型抗性时不仅看显著MTA的FAF，还纳入与MTA高LD（r²≥0.6）的非显著SNP聚类判断，避免了传统仅按领军SNP或严LD/短窗口剪枝遗漏稀有单倍型的问题；据此发现五个新型簇与相应供体（四份全有利等位基因型），适合标记辅助导入精英背景；该数据驱动框架可扩展至其他作物复杂性状的基因库挖掘。