克服批次变异性：一种基于化学成分明确XRS的绵羊体外胚胎生产系统

《Veterinary Medicine International》：Overcoming Batch Variability: A Chemically Defined XRS-Based System for Ovine In Vitro Embryo Production

　　

传统的绵羊胚胎体外成熟（IVM）和体外受精（IVF）系统依赖胎牛血清（FBS）和发情绵羊血清（ESS），这些血清存在批次变异性、伦理问题及供应限制等挑战。本研究评估了XRS Standard血清替代物作为绵羊体外胚胎生产（IVEP）中FBS和ESS的完全替代品。采用2×2析因设计，生成所有四种可能的IVM/IVF组合——FBS/ESS、FBS/XRS、XRS/ESS和XRS/XRS（每种添加剂在IVM和IVF培养基中均为10% v/v）。FBS/ESS组合作为传统对照组。量化了卵裂率（第2天）和囊胚发育率（第7天）。XRS/XRS组达到22.45%的囊胚率——是对照组（11.00%，p < 0.01）的2.0倍。FBS/XRS组显示出中等效果（15.43%），而添加ESS的组别发育能力降低（分别为12.71%和11.00%）。各组间总囊胚细胞数（122.1±22.3 vs. 126.0±22.4，p > 0.05）保持可比，表明胚胎质量得以保留。该方案在维持发育能力的同时消除了动物源性成分，符合3Rs原则（减少、优化、替代），并为商业化绵羊胚胎生产提供了可扩展的解决方案。

**研究背景与问题**
绵羊体外受精（IVF）是加速遗传增益和繁殖效率的关键技术。传统方案在成熟培养基中添加胎牛血清（FBS）以促进卵母细胞成熟，在受精培养基中添加发情绵羊血清（ESS）以促进精子获能。然而，依赖动物源性血清带来了关键限制：批次间变异性、供应链不稳定以及生物安全风险，阻碍了标准化和大规模应用。例如，ESS通过胆固醇外排和Ca²⁺内流机制诱导获能，但高浓度会上调凋亡转录本（如BAX和caspase-3），同时损害胚胎质量。将血清纳入胚胎培养系统已不再被认为可接受。因此，亟需开发不含动物源成分且能维持发育能力的无动物替代品。XRS Standard（XRSS10-500，杭州西锐无限生物科技有限公司）是一种新型溶液，旨在最小化动物源性输入并提高批次一致性。虽然FBS通常以10%（v/v）用于细胞系和原代细胞，初步剂量-反应实验确定10%（v/v）XRS为支持细胞增殖和生长动力学的最佳浓度。据研究人员所知，关于XRS在哺乳动物体外胚胎生产系统中经同行评审的评估仍然有限。本探索性研究考察了XRS添加对卵裂率和第7天囊胚发育的潜在影响，旨在为更可重复、伦理合理且可扩展的绵羊胚胎生产基础做出贡献。论文发表在《Veterinary Medicine International》。

**主要关键技术方法**
研究人员从当地屠宰场获取成年母羊卵巢（混合肉用品种，未记录遗传背景），采集卵丘-卵母细胞复合物（COCs）。采用2×2析因设计，在IVM和IVF阶段分别用XRS替代FBS和ESS，形成四个处理组（FBS/ESS、FBS/XRS、XRS/ESS、XRS/XRS），每组≥50个COCs，重复5次。关键方法包括：IVM使用M199培养基添加10% FBS或XRS及FSH、LH等；IVF采用上游法分离活动精子，在改良合成输卵管液（SOF）中添加10% ESS或XRS、肝素等；IVC在SOFaai培养基中进行；第7天囊胚用Hoechst 33342染色计数总细胞数。统计分析采用双因素方差分析（ANOVA）和Tukey HSD检验。

**研究结果**
**3.1 比较FBS或XRS Standard体外成熟24小时后的完全卵丘扩展**
在添加10% FBS或XRS Standard的M199培养基中成熟24小时后，所有COCs均显示完全卵丘扩展，两个补充组之间未观察到显著差异（图1）。

**3.2 IVM和IVF期间XRS添加对绵羊卵母细胞卵裂率和囊胚率的影响**
通过2×2析因设计评估XRS对绵羊IVEP的影响。XRS-XRS方案获得最高卵裂率（88.79%）和囊胚率（22.45%，p < 0.05），其次是FBS-XRS组合。相比之下，包含ESS的方案（XRS-ESS或传统FBS-ESS）产生最低发育指标；FBS-ESS组数值最弱，但差异在统计上不显著（p > 0.05）。具体而言，XRS-XRS组囊胚率较对照组提高2.0倍，FBS-XRS组为15.43%，XRS-ESS组为12.71%，FBS-ESS组为11.00%。

**3.3 血清替代物对囊胚总细胞数的影响**
各组间每个囊胚的总细胞数无差异（p > 0.05），表明XRS添加未影响植入前期的总体细胞增殖。Hoechst染色进一步证实囊胚细胞核均匀分布，支持XRS组胚胎质量未受损的结论。XRS-XRS组囊胚细胞数为127.40±19.438，对照组为122.17±22.311。

**讨论与结论**
讨论部分总结：XRS血清替代物在绵羊IVEP中优于传统血清。在IVM和IVF中完全替代FBS和ESS（XRS-XRS）显著改善了所有关键发育参数，囊胚率达22.45%（p ≤ 0.01 vs. FBS-ESS）。标准化配方可能更符合绵羊卵母细胞的代谢和信号需求。仅替换IVF培养基（FBS-XRS）产生中间结果，提示XRS的益处是累积的；保留ESS则持续抑制发育（≤67.82%卵裂率，≤11.00%囊胚率），这与ESS上调促凋亡和氧化应激通路的转录组证据一致。XRS在提高囊胚产量的同时未降低单个胚胎质量（总细胞数无差异），与牛IVF中其他血清替代物增强囊胚发育能力和冷冻耐受性的工作互补。使用化学成分明确的替代品消除了血清固有的变异性，提高了方案可重复性，符合3Rs原则。绵羊种群中布鲁氏菌（70.7%）、钩端螺旋体（55.2%）和流产衣原体（21.9%）的高血清阳性率凸显了人-动物疾病传播风险，XRS的采用与One Health原则一致。未来研究应聚焦XRS发挥有益作用的分子机制（如生长因子信号和氧化还原稳态）。研究人员还指出，ESS毒性而非XRS限制绵羊囊胚产量：低囊胚形成主要源于ESS在受精培养基中的细胞毒性，通过氧化应激和促凋亡级联反应抑制胚胎发育，尤其在非繁殖季节获取的卵母细胞或形态选择不严格时更为明显。完全替代血清可克服这一障碍。

结论部分翻译：2×2析因实验表明，用XRS完全替代IVM中的FBS和IVF中的ESS（XRS-XRS）显著提高了卵裂率和囊胚率，且不损害总细胞数。因此，这种明确的、无血清的方案为绵羊IVEP提供了一个稳健、可重复且生物安全的平台，并为优化其他家畜物种的胚胎生产方案建立了可转移的参考。