温度与内在Ca2+重塑TRPM4药理学

《Nature Structural & Molecular Biology》：Temperature and intrinsic Ca2+ reshape TRPM4 pharmacology

　　

蛋白质的活性本质上由其所在的细胞环境所调控。包括离子、脂质、温度、pH以及蛋白质-蛋白质相互作用在内的多种因素共同决定了蛋白质在其天然环境中的功能方式。然而，由于技术限制，大多数生物物理学和药理学研究在简化条件下进行，虽获得了基础性认识，但往往未能捕捉完整的生理复杂性。与温度并行的另一个内在生理变量是细胞内Ca²⁺浓度，其对蛋白质行为具有广泛影响。Ca²⁺通过专用结合位点直接调控多种蛋白质，或间接通过Ca²⁺依赖性信号级联反应发挥作用。尽管Ca²⁺的结构和功能角色已被广泛表征，但其对蛋白质-配体相互作用的影响——特别是与其他内在因素如温度联合作用时——却鲜少被考虑。

瞬时受体电位褪黑素4（transient receptor potential melastatin 4, TRPM4)是一种Ca²⁺激活、温度敏感的离子通道，是研究内在生理因素如何影响药物反应的理想模型。TRPM4为非选择性单价阳离子通道，其被升高的胞质Ca²⁺水平激活后导致Na⁺内流和膜去极化，进而调控心脏传导、胰岛素分泌、神经元兴奋性、免疫调节和肠道液体稳态等多种下游过程。致病性变异与Brugada综合征及其他遗传性传导障碍、多种癌症相关。在此背景下，TRPM4拮抗剂在TRPM4过度活性导致病理性去极化和传导缺陷的心脏疾病中可能具有治疗价值，而TRPM4激动剂则可能在TRPM4上调且增强通道活性与坏死性细胞死亡通路相关的某些癌症中具有意义。

研究人员此前的结构和功能研究揭示，TRPM4存在两种主要构象——"冷"态和"暖"态，其平衡由温度和胞质Ca²⁺浓度共同调控。在冷构象中，Ca²⁺专一结合于S1-S4束中的激动剂位点（Ca^TMD），产生强烈外向整流电流。相反，在暖构象中，细胞内结构域发生显著重排，伴随额外的细胞内位点（Ca_warm或Ca^ICD）上的Ca²⁺结合， resulting in电流较少外向整流并表现出显著的内向电导。这些发现表明，在室温和未定义Ca²⁺条件下进行的生物物理学和药理学检测可能无法准确捕捉通道在生理设定下的行为。

本研究中，研究人员系统性地在同时纳入温度和Ca²⁺的条件下检测了TRPM4药理学。通过联合低温电子显微镜（cryogenic electron microscopy, cryo-EM）和电生理学，揭示这些内在因素深刻塑造配体识别、效能和机制。研究结果确定S1-S4结构域为整合环境和化学信号以调控激活与抑制的动态调节中枢。更广泛而言，这项工作建立了环境感知的药理学框架，其中纳入内在变量可揭示隐藏的药物活性和新的调控机制。对于广泛表达的蛋白质如TRPM4，这些原则为设计利用病理局部条件——如异常升高的Ca²⁺水平或改变的温度状态——进行疾病选择性治疗同时保留正常生理功能并最小化副作用提供了机会。

本研究以瞬时受体电位褪黑素4（transient receptor potential melastatin 4, TRPM4）为模型，系统探究了温度与胞内钙离子（Ca²⁺）这两种内在生理变量如何重塑离子通道的药理学特性，为环境感知型药理学提供了重要理论基础。

研究背景与问题提出

蛋白质在其天然细胞环境中受多种因素调控，包括离子、脂质、温度、pH及蛋白质-蛋白质相互作用等。然而，受技术条件所限，传统生物物理学和药理学研究多在简化条件下进行，尤其忽略了温度这一基本决定因素——人体蛋白质在37°C下运作，而大多数体外实验却在室温或更低温度下进行。与此同时，尽管Ca²⁺作为最严格调控的细胞辅因子之一，其浓度在静息至信号传导过程中动态波动，但Ca²⁺对蛋白质-配体相互作用的影响，特别是与温度等其他因素的协同作用，尚未得到充分研究。

TRPM4是一种Ca²⁺激活、温度敏感的非选择性单价阳离子通道，其激活导致Na⁺内流和膜去极化，参与调控心脏传导、胰岛素分泌、神经元兴奋性、免疫调节和肠道液体稳态等过程。TRPM4的致病性变异与Brugada综合征、其他遗传性传导障碍及多种癌症相关。该通道先前被确定存在"冷"态和"暖"态两种主要构象，其平衡由温度和胞质Ca²⁺浓度共同调控。基于这一背景，研究人员提出核心问题：在非生理性条件下进行的药物筛选是否可能遗漏活性化合物？温度依赖性配体识别是否仅限于发生大幅构象变化的区域？

研究开展与主要结论

研究人员通过联合冷冻电镜（cryo-EM）和膜片钳电生理学技术，系统检测了多种已知TRPM4配体在不同温度和Ca²⁺条件下的活性。研究对象包括：先前被视为TRPM4无活性的三苯基磷氧化物（triphenylphosphine oxide, TPPO）、坏死性激活剂Ncnps-1（Necrocide-1, NC1），以及目前表征最充分的TRPM4抑制剂NBA（4-chloro-2-(2-(naphthalene-1-yloxy)acetamido)benzoic acid）和其类似物CBA（4-chloro-2-[2-(2-chloro-phenoxy)-acetylamino]-benzoic acid）。

研究发现，温度与Ca²⁺以三种截然不同的方式重塑TRPM4药理学：第一，TPPO、温度和Ca²⁺存在三方协同作用——在生理温度和Ca²⁺条件下，原本被认为对TRPM4无活性的TPPO转变为强效激活剂，其效力在37°C和基础Ca²⁺条件下增强约14倍；第二，NC1表现出Ca²⁺依赖性门控反转——在无Ca²⁺时激活通道，但在Ca²⁺达到激活水平时其功能被拮抗；第三，NBA和CBA通过结合S1-S4结构域中的新位点，将通道锁定在非导电的前开放状态，且其抑制作用不受温度影响。这些发现揭示了即使结构相对刚性的结合口袋也可表现出温度依赖性配体识别，为选择性、环境感知的治疗策略设计提供了依据。

关键技术方法

本研究主要运用了以下关键技术：膜片钳电生理学技术，在tsA细胞中对过表达野生型及突变型TRPM4进行全细胞记录，分别在室温（22°C）和生理温度（37°C）、不同游离胞内Ca²⁺浓度（0 μM、0.1 μM、1 μM）条件下检测化合物活性；单颗粒冷冻电镜技术，解析TRPM4与不同配体在多种温度和Ca²⁺条件下的高分辨率结构（分辨率约2.5-2.9 ?），包括TPPO结合态、NC1结合态、NBA结合态及CBA结合态；结构分析方法，通过单亚基分类识别通道的不同构象状态，并进行结构比较以揭示配体结合的分子机制；定点突变与电生理学功能验证相结合，确认关键氨基酸残基在配体识别中的作用。

研究结果

温度揭示TRPM4的隐藏药理学

研究人员首先检测了TPPO、NC1、NBA和CBA在不同条件下的活性。在先前报道的实验条件下——室温配合无游离胞内Ca²⁺或基础水平游离胞内Ca²⁺（100 nM）——研究成功复现了已建立的结果：50 μM TPPO对TRPM4几乎无活性；NC1激活通道，诱发大体线性的、电压非依赖性电流；NBA和CBA产生稳健的Ca²⁺诱导TRPM4电流抑制。将温度升高至37°C后，NC1、NBA和CBA保持其室温特征，但TPPO表现出完全不同的反应——稳健地激活TRPM4电流。这些观察凸显了传统药理学筛选中的关键缺陷：在非生理条件下进行的检测既可能遗漏潜在活性化合物，也可能错误分类配体选择性。

TPPO、温度与Ca²⁺的三方协同作用

在无Ca²⁺条件下，50 μM TPPO对TRPM4几乎无激活作用。添加100 nM游离胞内Ca²⁺后，即使该浓度本身不足以打开通道，却显著增强了TPPO诱导的TRPM4激活。定量分析显示，在生理温度下，基础Ca²⁺使TPPO效力增加约14倍；而在37°C时，基础Ca²⁺使TPPO效力增强约6倍。当胞内Ca²⁺升至激活浓度（1 μM）时，TPPO的效应在很大程度上被掩盖，电流形态与单独Ca²⁺激活相似。这些观察与TPPO和Ca²⁺通过共享激活通路作用一致，在高Ca²⁺浓度下Ca²⁺成为通道行为的主导决定因素。这些数据证明，生理背景对TPPO效能至关重要，揭示了温度、Ca²⁺和配体结合之间的三方协同作用，彻底推翻了TPPO对TRPM4无活性的观点。

Ca²⁺作为TRPM4激动剂识别和效力的关键决定因素

研究人员进一步探究Ca²⁺是否调节外源性激活剂TPPO和NC1的结合与效力。在无Ca²⁺条件下，NC1诱发了与Ca²⁺存在时几乎相同的线性电流-电压关系电流，证实NC1可以独立激活TRPM4，其半数有效浓度（half-maximal effective concentration, EC₅₀）处于亚微摩尔范围。然而，在1 μM Ca²⁺——细胞应激时具有生理相关性的水平——下，反应发生戏剧性变化，变得强烈外向整流，这是典型Ca²⁺介导激活的标志。这种显著反转表明，一旦Ca²⁺达到激活水平，其自身作用占据主导，功能上掩盖了NC1介导的门控，即使在饱和NC1浓度下亦然。NC1显示双相Ca²⁺依赖性：在基础Ca²⁺水平时具有活性，但在较高Ca²⁺浓度下几乎无额外效应。这与TPPO形成鲜明对比，说明同一内在辅因子可通过协同或拮抗耦合差异性地调节配体作用。

TPPO、温度与Ca²⁺三方协同的结构基础

为阐明温度和Ca²⁺如何塑造TPPO激活TRPM4，研究人员解析了TPPO存在下18°C和37°C、Ca²⁺游离及Ca²⁺饱和条件下的cryo-EM结构。在37°C Ca²⁺-TPPO-TRPM4数据集的一致图中，每个原聚体的S1-S4结构域中观察到明显的三脚形密度，与TPPO形状匹配，位于Ca^TMD位点正上方，被命名为S1-S4_upper位点。亚基水平的分类显示，暖态和冷态在该数据集中共存，暖态占主导，配体密度在暖态中明显更强。在该口袋中，TPPO占据疏水腔，其磷酸基团与TRP螺旋上的R1072形成关键极性相互作用。R1072A突变保留了Ca²⁺诱发的门控但消除了TPPO依赖性激活，证实了TPPO结合位点的功能相关性。

在18°C Ca²⁺-TPPO-TRPM4数据集的Ca²⁺结合冷构象中，S1-S4_upper位点仅在很低轮廓水平下可辨认为微弱且不完整的信号。在37°C EGTA-TPPO-TRPM4数据集的Ca²⁺游离冷构象中，该特征完全消失，无TPPO密度可检测。因此，TPPO结合表现出对TRPM4冷-暖构象平衡的明显依赖性，这一转变由温度和Ca²⁺浓度协同调控。结构观察与电生理学发现一致，共同表明TPPO效能与这两个内在调节因子定义的构象景观紧密耦合。

结构比较揭示了机制基础：在Ca²⁺游离冷构象中，R1072从S1-S4_upper口袋移位，通过与参与Ca<sup>TMD结合的Q831相互作用而被稳定，从而阻止TPPO结合。转变为暖态后，细胞内结构域的上移倾斜TRP螺旋，使R1072进入TPPO协调位置。同时，Ca2+在CaTMD位点的结合招募Q831进行Ca2+协调，释放R1072以与TPPO磷酸基团直接相互作用。这些耦合重排共同为有效配体参与准备了S1-S4_upper口袋。

NC1 Ca2+依赖性门控反转的机制基础

研究人员解析了37°C下Ca2+游离和Ca2+结合条件下NC1-TRPM4复合物的cryo-EM结构。在Ca2+游离数据集中，S1-S(a)S1-S4结构域中观察到清晰的NC1密度，占据与TPPO和脱乙酰比沙可啶相同口袋。NC1与TPPO以相似姿态结合，其吲哚酮羰基氧与TRP螺旋上的R1072形成关键极性接触。R1072等结合位点残基的丙氨酸取代消除了或显著降低了NC1介导的激活。

在Ca2+结合数据集中，相同S1-S4_upper口袋的NC1密度明显减弱，与1 μM Ca2+强烈抑制NC1诱发线性电流的电生理学发现一致。虽然不能完全排除NC1与Ca2+共结合产生类似单独Ca2+电生理学特征的可能性，但Ca2+结合结构中NC1密度的显著减弱表明，Ca2+依赖性NC1结合减少或近乎消除是最可能的解释。这种拮抗作用并非源于对共享位点的直接竞争，而是源自NC1口袋与CaTMD位点之间的变构干扰。Ca2+协调伴随两种局部结构变化：一是Ca2+结合重新定位TRP螺旋，使R1072远离NC1识别核心的吲哚酮羰基氧；二是Ca2+结合使带正电的R905接近NC1的疏水七元环己基环，产生静电上不利的并置，进一步破坏配体结合。这些拮抗性重排共同解释了为何NC1亲和力在Ca2+浓度升高时下降。

NC1覆盖Ca2+依赖性ICD-TMD变构调控

NC1的显著特征是它无需Ca2+在两个调控位点中的任何一个即可激活TRPM4。在典型门控中，Ca2+和温度协同耦合细胞内结构域（intracellular domain, ICD）和跨膜结构域（transmembrane domain, TMD）以驱动激活：Ca2+结合于温度敏感的CaICD使通道从冷态转为暖态，建立Ca2+在CaTMD结合以在生理相关膜电位下打开孔道的预激活构象。结构比较显示，从Ca2+游离冷态到Ca2+结合暖态的转变涉及ICD的大幅重排及TRP螺旋和TMD的显著移位。相反，在NC1结合结构中，ICD保持类冷态，但TMD即使在没有CaTMD位点Ca2+的情况下也 closely resembles暖态构象。这些观察表明NC1在功能上替代了TMD处的Ca2+，同时独立于ICD处的Ca2+依赖性预激活。

电生理学支持这一模型：NC1在室温和生理温度均诱发了幅度相当的稳健电流——与Ca2+依赖性TRPM4激活形成对比，后者通过CaICD介导的ICD-TMD耦合在37°C时显著增强。因此，NC1激活通道无需参与CaICD驱动的变构调控。E396A突变体验证了这一机制，该突变中CaICD结合被消除，TRPM4无论温度如何均被锁定在类冷态构象，而NC1仍产生强大的、温度非依赖性激活。

NBA和CBA通过S1-S4_lower位点抑制TRPM4

药理学抑制TRPM4具有广泛的临床重要性，因为通道过度激活促致心律失常性心脏疾病、缺血性损伤和癌症进展。研究人员此前揭示，内源性拮抗剂ATP在生理温度下显著丧失效力，因其结合位置在通道冷态和暖态构象间发生偏移，限制了ATP在正常细胞条件下抑制TRPM4的能力。

为鉴定在生理构象景观中保持有效的抑制剂，研究人员转向NBA及其类似物CBA。与ATP和其他温度敏感配体不同，NBA和CBA以温度非依赖性方式抑制TRPM4，在37°C保持高效力。37°C Ca2+存在下的cryo-EM分析在两个数据集均揭示了一个先前未知的S1-S4结构域配体结合位点，存在于冷态和暖态构象中。该位点位于CaTMD位点下方、S1-S4_upper口袋相邻，故被命名为S1-S4_lower位点。

在两个抑制剂中，氯苯基-羧基向上指向S1-S4结构域，其羰基由S4上的R905和TRP螺旋上的R1072两个带正电残基稳定。NBA或CBA的远端芳香基团向下延伸至S4-S5连接子和TRP螺旋形成的腔中。Q1061的取代也显著降低了抑制作用，验证了S1-S4_lower口袋作为NBA和CBA功能性结合位点的作用，确定了S1-S4结构域中第二个药理学活性位点。

NBA和CBA通过锁定前开放构象抑制TRPM4

为阐明NBA和CBA如何抑制Ca2+依赖性激活，研究人员首先检查了典型TRPM4门控的基础构象转变。在Ca2+游离冷态中，S3上的W864和S4上的H908形成稳定的π-π堆积相互作用。Ca2+结合后，CaTMD和CaICD的协调参与触发S1-S4束和TRP螺旋的重排，使W864和H908重新定位，从而破坏S3和S4螺旋细胞内尖端之间的接触——这是Ca2+门控TRPM通道激活的标志。这释放了S4-S5连接子，允许S5-S6孔道结构域开放。

在Ca2+-NBA和Ca2+-CBA结合结构中，这一转变被阻断。NBA或CBA的远端芳香基团占据了激活态中H908正常占据的位置，从而迫使H908保持其apo态构象。结果，H908、W864和配体形成π-π-π三重堆积相互作用，约束S4-S5连接子并阻止孔道开放。被抑制态的整体结构与Ca2+结合暖闭合构象高度匹配（主链均方根偏差0.7 ?），表明NBA和CBA将TRPM4捕获在Ca2+预激活但非导电的前开放状态。

为验证这一模型，研究人员使用了十钒酸盐（decavanadate, DVT），其先前被证明结合于ICD-TMD界面并通过拉动孔道成衬的S6螺旋使TRPM4从Ca2+结合前开放态转变为开放态。研究人员推断，如果NBA和CBA稳定Ca2+结合前开放态，它们应阻止DVT结合和激活所需的构象变化，甚至完全排除DVT结合。Ca2+、DVT和CBA存在下37°C的TRPM4结构解析仅含Ca2+和CBA密度，无DVT结合证据，且蛋白质构象与Ca2+-CBA结合闭合态相同，为提出的抑制机制提供了直接结构证据。

讨论与结论

本研究揭示了TRPM4药理学并非静态，而是受生理环境动态塑造，温度和细胞内Ca2+作为配体结合、效能和机制的主动决定因子发挥作用。通过整合单颗粒冷冻电镜和电生理学，这些内在因素协同重塑TRPM4的构象景观，暴露潜在结合位点并揭示在非生理条件下被掩盖的情境依赖性药理学行为。

研究结论指出：生理背景揭示了配体的真实药理学特征。长期被视为TRPM5特异性抑制剂的TPPO，在此 emerge为TRPM4的强效激活剂，但仅在温度和细胞内Ca2+均达生理水平时；相反，先前被描述为Ca2+非依赖性激动剂的NC1发生功能反转：在基础Ca2+浓度时激活TRPM4，而在升高Ca2+时被功能拮抗，揭示了Ca2+调控的意外抑制面向。这些对比行为的发生机制在于，温度和Ca2+协同决定TRPM4冷态与暖态之间的平衡，从而调控S1-S4调控结构域中关键残基的可及性。因此，TRPM4中的配体效能并非化合物本身的内在属性，而是其与通道构象和热力学景观相互作用的涌现后果。

结构分析确立了S1-S4结构域作为整合环境和化学输入的多功能药理学枢纽。在该结构域中，围绕CaTMD位点，两个空间不同但功能耦合的位点控制相反的门控结果：容纳激活剂TPPO、NC1和脱乙酰比沙可啶的S1-S4_upper口袋，以及被抑制剂NBA和CBA靶向的S1-S4_lower口袋。两个口袋汇聚于TRP螺旋，保守残基R1072作为连接环境信号与门控转换的关键变构节点。上位口袋的配体参与促进S1-S4结构域与孔道结构域之间的耦合以激活，而下位口袋的配体结合则破坏这一耦合，稳定非导电态。

研究进一步发现，TRPM4中的温度依赖性配体识别并不限于发生大规模重排的区域。即使在结构相对稳定的结构域中——如仅表现微妙温度驱动运动的S1-S4跨膜束——配体可及性和效能也可发生显著变化。这一原则很可能扩展至许多药物靶点，突显看似刚性的结构区域可能隐藏着隐性的、环境敏感的药理学。

更广泛而言，这些发现支持环境感知的药理学框架，其中生理性变量如温度和细胞内Ca2+水平作为配体结合、效力和效能的主动调节因子，而非被动背景条件。对于TRPM4等广泛表达的蛋白质，这些原则具有重要的治疗意义：通过利用局部生理变化——如应激期间升高的细胞内Ca2+水平或疾病中的改变温度状态——未来药物可定制为在病理情境中选择性作用，同时保留正常功能。这种环境敏感的设计策略可减少副作用，为精准药理学提供新途径。</sup>