模拟再生障碍性贫血患者的骨髓衰竭模型：免疫细胞反应的单细胞图谱揭示AA免疫失衡的新机制

《Cancer Medicine》：Bone Marrow Failure Model Mimics Aplastic Anemia Patients: Single-Cell Landscape of Immune Response Reveals Novel Mechanisms of Immune Imbalance in AA

　　

摘要：再生障碍性贫血（Aplastic Anemia, AA）中造血干/祖细胞（Hematopoietic Stem/Progenitor Cells, HSPCs）受损的发病机制尚不清楚。本研究聚焦CD8+T细胞，并探讨血小板、CD4+T细胞、巨噬细胞及线粒体能量代谢，旨在阐明与骨髓衰竭（Bone Marrow Failure, BMF）相关的细胞图谱变化。研究人员成功建立了骨髓衰竭小鼠模型，并在单细胞水平分析了免疫应答。结果显示，血小板通过释放PF4调控CD4+/CD8+T细胞及巨噬细胞；CXCR3/CXCR5结合PF4后激活线粒体信号通路；调节性T细胞（Treg）减少削弱免疫抑制功能；CD8+效应T细胞显著增多；CD8+应激T细胞能量代谢增强。需注意AA中血小板本身减少会削弱能量代谢从而损害止血与血栓形成功能，但血小板对免疫细胞的调控作用仍显著。巨噬细胞M1/M2极化失衡。骨髓衰老中特征性巨噬细胞和CD8+初始T细胞虽为重要表型，但不参与病理性衰竭。结论：AA中BMF的可能机制为——基于PF4的血小板–T细胞/巨噬细胞互作导致免疫过度活化并释放IFN-γ、TNF-α等细胞因子攻击骨髓。因此，通过抑制血小板免疫调节功能，将失衡的CD8+效应T细胞、应激T细胞、Treg细胞及M1/M2巨噬细胞向CD8+初始T细胞和特征性巨噬细胞转化，可能为逆转BMF提供新策略。

研究背景与目的

再生障碍性贫血（Aplastic Anemia, AA）是一种获得性免疫介导的骨髓衰竭（Bone Marrow Failure, BMF）综合征，以全血细胞减少和骨髓细胞稀少为特征。由于AA患者骨髓取材困难且细胞量极少，造血干/祖细胞（Hematopoietic Stem/Progenitor Cells, HSPCs）损伤的具体机制尚未明确，既往研究多聚焦于CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocytes, CTLs）对HSPCs的直接攻击，而血小板、CD4⁺T细胞、巨噬细胞及线粒体代谢在BMF中的作用不清，且缺乏对免疫细胞网络整体互作的解析。为克服临床样本限制，研究人员建立免疫介导的BMF小鼠模型（模拟人类AA病理），首次应用单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq, scRNA-seq）联合抗体标记测序（Antibody Sequencing, AbSeq）技术，绘制骨髓免疫细胞单细胞图谱，重点探究血小板–免疫细胞互作及PF4（Platelet Factor 4 / CXCL4）介导的免疫失衡机制。该研究发表于《Cancer Medicine》。

主要关键技术方法

研究人员将8–12周龄B6D2F1雄鼠（C57BL/6♀×DBA/2♂子一代）设为受者，分为四组：正常青年小鼠（Wild Type, WT）、正常老年小鼠（Aged, 104周）、全身照射对照组（Total Body Irradiation, TBI, 5.0 Gy）和BMF模型组（TBI后4 h尾静脉注射4×10⁶个C57BL/6供体淋巴结淋巴细胞）。采用BD Rhapsody平台进行scRNA-seq＋AbSeq（25种免疫细胞表面抗原抗体），特意在质控中保留血小板及线粒体信息；应用多组学因子分析（Multi-Omics Factor Analysis, MOFA）整合RNA与蛋白数据注释17种主要细胞类型；对T/NK细胞、巨噬细胞等进行亚群细分；利用CellChat推断细胞–细胞互作（Cell–Cell Interaction, CCI）；进行差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）分析、GO与Reactome通路富集、功能模块评分（AddModuleScore）及拟时序（Pseudotime）分析；并行骨髓病理HE及免疫组化、外周血常规检测验证建模表型。

研究结果

3.1 基于PF4的血小板–T细胞/NK细胞/巨噬细胞互作及AA中免疫失衡驱动因素

通过单细胞图谱与细胞互作分析发现，BMF组中血小板释放PF4结合CD4⁺/CD8⁺T细胞表面CXCR3及CXCR5，激活下游炎症与线粒体代谢信号；Treg减少致免疫抑制减弱，CD8⁺效应T细胞与CD4⁺Tfh增多分泌IFN-γ，M1巨噬细胞占优并释放TNF-α、IL-1β攻击HSPCs，形成促炎–抑炎"跷跷板"失衡，驱动BMF。老年骨髓中出现的特征性Mph05巨噬细胞（Pf4^hiCd68^hiTimd4^hiApoc1^hiS100a8/a9^hiCd163^dimCD86^dimC1qa^dim）及CD8⁺初始T细胞增多，但不引起病理性衰竭。

3.2 BMF小鼠模型骨髓单个核细胞（BMMCs）的单细胞转录组分析

成功构建BMF模型（体重下降、HGB/WBC/PLT显著降低、骨髓增生减低）。scRNA-seq共鉴定17个细胞簇，BMF组总细胞数减少，存活细胞中CD8⁺T细胞比例升高，巨噬细胞比例显著增加，HSPCs大幅耗减。

3.3 BMF中CD8⁺与CD4⁺T细胞免疫失衡，T细胞膜受体CXCR3表达增强

T/NK细胞亚群分析显示BMF组NK细胞几乎消失，CD4/CD8比值降低，CD8⁺效应T细胞为主、初始T减少，Tfh升高、Treg降低。CXCR3在CD4⁺Treg和CD8⁺初始T不表达（致Treg无法被PF4–CXCR3轴扩增），而在其他T细胞高表达；CXCR5主要在CD4⁺/CD8⁺TEM（Effector Memory T cells）表达。通路富集示BMF的CD4⁺增殖T细胞中固有免疫负调控上调。

3.4 BMF中M1/M2失衡及老年组出现Mph05巨噬细胞

BMF组巨噬细胞总数最多但Mph05极少，M1比例高于M2；WT/TBI以M2为主；Aged组近100%为Mph05（见于年轻与老年骨髓但不致病）。Mph05高表达Pf4、Apoc1、S100a8/a9，低表达Cd163、C1qa，具中等M1与M2评分，不同于经典M1/M2及M4（MMP7⁺S100A8⁺）。

3.5 BMF中血小板与T细胞、巨噬细胞互作增强

PF4特异性高表达于血小板。CellChat显示BMF组血小板作为受体时与单核/巨噬细胞前体（Monocyte/Macrophage Progenitors, MP）互作最强；血小板–T细胞及血小板–MP配体–受体对显著增多。老化组血小板高表达PGC1α/AMPK/Akt通路蛋白，BMF组该通路减弱。

3.6 T细胞与巨噬细胞拟时序分析

T细胞轨迹示Aged组Treg分布于末端，BMF组CD4⁺Tfh和CD8⁺效应T贯穿全程；CXCR3表达随拟时序在BMF组达峰。巨噬细胞轨迹示BMF组M1/M2集中（M1＞M2），Aged组Mph05分布早晚期；TFAM（Mitochondrial Transcription Factor A）在线粒体通路于BMF组巨噬细胞有表达。

3.7 BMF期间血小板释放PF4与T细胞及巨噬细胞发生互作/串扰

CCI热图显示BMF组MP–MP自身配受体对数最多，血小板–CD4⁺/CD8⁺T、血小板–MP、血小板–自身配体–受体对明显增多。PF4–CXCR3为血小板作用于T细胞的关键信号轴。

3.8 基因及对应蛋白表达

MOFA示Adgre1、Tfrc、Kit、Il2ra、Il12rb1相关性升高，Cd8a、Cxcr2、Pdcd1、Ptprc相关性降低；部分基因（如Cd4）RNA高但对应抗体信号低，提示转录–蛋白解偶联。

3.9 BMF T细胞中线粒体能量代谢通路/TFAM表达增强

CD8⁺应激T细胞（Stress T cells）TFAM高表达（TBI组几乎无）；Aged组M1巨噬细胞TFAM高；BMF组Mph05也表达TFAM。WT组M2巨噬细胞PhosphoAkt/JAK/ROS高于BMF；BMF组初始B细胞不表达AMPK但NOTCH/IFNG/NF-κB/P53高。

3.10 BMF中HSPCs、中性粒细胞及B/浆细胞特征

BMF组HSPCs显著减少，残存以中性粒前体（～50%）和巨核/血小板（～25%）为主，B系消失。中性粒细胞总数锐减，残留以Neu02/Neu03为主且凋亡/炎症通路上调。B细胞三种亚型均降，残存以浆细胞为主，其凋亡及蛋白翻译后修饰通路上调。Aged组B系祖细胞减少但抗病毒应答上调。

3.11 长链非编码RNA（lncRNA）

BMF组Hotairm1在MP高表达，Dleu2在NK最高；TBI组H19在GMP/NeuPre高，Hotairm1在MP/MDP高，Ttc39aos1在GMP/MDP高。

讨论与结论翻译

讨论指出本研究弥补了既往仅关注CD8⁺CTL的不足，证实PF4–CXCR3/CXCR5–线粒体Akt-PGC1α-TFAM轴介导血小板调控T细胞活化与Treg减少、CD8⁺效应T及Tfh扩增、M1优势极化，形成免疫失衡致HSPCs破坏；老化相关Mph05为生理表型不参与BMF；NK耗减削弱自身免疫调控；S100A8/A9高表达可能联系TLR4/NF-κB促炎并潜在向髓系肿瘤演进；研究局限含种属差异、小样本及缺临床标本验证。

结论：AA中BMF的可能机制为——基于PF4的血小板–T细胞/巨噬细胞串扰导致免疫过度活化并释放IFN-γ和TNF-α等细胞因子攻击骨髓。因此，通过抑制血小板免疫调节功能，将失衡的CD8⁺效应T细胞、应激T细胞、Treg细胞及M1/M2巨噬细胞转变为CD8⁺初始T细胞和特征性（a phenotype）巨噬细胞，可能为逆转BMF提供有前景的策略。