基于普鲁士蓝(Prussian Blue, PB)的短路模式微传感器：用于局部过氧化氢(H2O2)检测的简化方法

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Prussian Blue–based microsensors in short-circuit mode: a simplified approach for localized hydrogen peroxide detection

　　

研究人员报道了一种基于普鲁士蓝(PB)的、集成银准参比电极(quasi-reference electrode, QRE)的微传感器，利用PB优异的电催化性能在所谓短路(short-circuit)模式下对过氧化氢(H2O2)进行选择性还原检测。这种"单电极"构型无需恒电位仪，可实现简化的信号读出。该微传感器基于PB或PB-镍铁氰化物(PB-nickel hexacyanoferrate, PB-NiHCF)，表现出高灵敏度（PB基和PB-NiHCF基微传感器的灵敏度分别为1.8 A M?1cm?2和0.32 A M?1cm?2）、操作稳定性（在1 mM H2O2苛刻条件下性能维持4 h），以及对H2O2的高选择性——常见还原干扰物如抗坏血酸和儿茶酚胺几乎无响应。通过引入铂黑(platinum-black, Pt-B)亚层可显著改善PB膜沉积，使灵敏度提高3倍，操作稳定性增强14倍。该微传感器成功用作扫描电化学显微镜(scanning electrochemical microscopy, SECM)探针以绘制H2O2生成分布图。此外，通过在PB修饰铂微电极(microelectrode, ME)上固定葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, GOx)和己糖激酶(hexokinase, HEX)，构建了腺苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)微生物传感器并用于胞外ATP释放检测。ATP测定依赖于GOx和HEX对葡萄糖的竞争催化反应。这些结果凸显了短路模式下PB基微电极不仅在以监测H2O2浓度为主要目标的催化体系局部电化学研究中，也在H2O2作为酶促反应副产物生成的生物体系（如活细胞）研究中的重要潜力。

论文解读：基于普鲁士蓝(PB)短路模式微传感器的局部H₂O₂检测及ATP生物传感应用

一、研究背景与意义

过氧化氢(H₂O₂)是化工生产、消毒灭菌中的重要氧化剂，也是活细胞内关键的活性氧(reactive oxygen species, ROS)信号分子和免疫细胞氧化应激标志物，同时是氧化酶（如葡萄糖氧化酶，glucose oxidase, GOx）催化的主要产物，因此成为最广泛使用的生物传感器基础检测物。常规分析方法只能给出溶液本体(bulk)浓度，而生物医学研究（如单细胞研究）中H₂O₂常在微米尺度域产生，且本体浓度常低于检测限，需要进行局部(localized)定量检测。扫描电化学显微镜(scanning electrochemical microscopy, SECM)是获取氧化还原活性物质空间分布信息的强有力技术。

传统SECM用铂(Pt)或铂黑(platinum-black, Pt-B)微电极(microelectrode, ME)在较正电位下氧化H₂O₂，易受抗坏血酸、多巴胺等易氧化物质干扰；过氧化物酶基微生物传感器虽有酶选择性但酶稳定性有限。普鲁士蓝(Prussian Blue, PB)被称为"人造过氧化物酶"，可在近0 V vs. Ag/AgCl电位下催化H₂O₂还原，大幅降低干扰。但PB在中性或碱性介质中长期运行稳定性差，可被还原生成的OH^?溶解。PB与过渡金属六氰合铁酸盐（如镍铁氰化物nickel hexacyanoferrate, NiHCF）形成杂化膜可提高稳定性。此外，PB基传感器近期被证实可在短路(short-circuit)模式下工作——将PB修饰丝网印刷电极与Ag准参比电极(quasi-reference electrode, QRE)短接，零外接电位下电流表读取的电流与H₂O₂浓度成正比，消除恒电位仪需求并降低噪声，但此前仅用于大尺寸宏电极，尚未拓展至SECM兼容的微传感器。本研究旨在开发集成Ag QRE的PB及PB-NiHCF基H₂O₂微传感器，在短路模式下实现高选择性、高稳定性局部H₂O₂成像及ATP微生物传感检测。论文发表于Analytical and Bioanalytical Chemistry。

二、主要关键技术方法

研究人员采用?=25 μm Pt丝真空封入硼硅酸盐玻璃毛细管，研磨抛光制成Pt微电极(ME)；采用SnCl₂敏化毛细管外壁后用Tollens试剂还原沉积Ag层作QRE，构成单探头一体化电极。PB通过循环伏安法(cyclic voltammetry, CV)电沉积于Pt-ME或Pt-B修饰Pt-ME上；PB-NiHCF采用PB与NiHCF层交替CV沉积后80 °C退火1 h。Pt-B通过在含H₂PtCl₆和Pb(NO₃)₂的PBS中以?0.06 V恒电位沉积获得。ATP生物传感器在PB/Pt-ME上电聚合聚苯并噁嗪(benzoxazine, BA-TEPA)固定GOx与HEX。电化学测试：三电极体系用CHI660C或PalmSens 4；短路模式用PalmSens 4零电阻电流计(zero resistance ammeter, ZRA)模式直接将PB-ME与Ag QRE短接测电流。SECM采用自建装置恒高度模式(距基底20 μm)进行基底产H₂O₂/尖端收集(tip-generation/substrate-collection, SG/TC的反向操作即tip-collection)成像。细胞实验用从Sprague-Dawley大鼠肺分离培养的II型肺泡上皮细胞(alveolar type II cells, ATII)，在倒置荧光显微镜下将ATP微传感器定位距细胞层约20 μm，加葡萄糖后用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)刺激ATP释放并记录短路模式电流。

三、研究结果

Prussian Blue–based microsensor for H₂O₂detection in short-circuit mode（基于PB的短路模式H₂O₂微传感器）

研究人员将Ag QRE沉积于包裹Pt丝的玻璃毛细管外壁，SEM及EDX证实Ag涂层存在，抛光露出Pt盘和Ag环构成组合电极。PB电沉积于Pt微盘上，对比内置Ag QRE与外部Ag/AgCl参比电极的CV，电位偏移约20 mV，证明Ag QRE可用。分别在常规三电极于?0.05 V和短路模式下测试，PB微传感器灵敏度均为1.8±0.1 A M^?1cm^?2，响应时间<10 s，线性范围1–100 μM H₂O₂，二者分析性能相当。选择性实验表明裸Pt-ME对干扰物（抗坏血酸等）响应高于H₂O₂，Pt-B-ME相当，而PB基微传感器仅对H₂O₂产生还原阴极电流，需10倍抗坏血酸/去甲肾上腺素或70倍多巴胺才产生相当信号，且检出限(191±10 nM)显著低于裸Pt(2.9±0.2 μM)。短路模式下Ag氧化溶出提供电子将PB还原为普鲁士白(Prussian White)，后者催化还原H₂O₂再生PB，形成自持法拉第电流正比于H₂O₂浓度。

High-stability H₂O₂microsensors（高稳定性H₂O₂微传感器）

先在Pt-ME上沉积多孔Pt-B（通过[Ru(NH₃)₆]³⁺CV评估电活性表面积EASA增至0.0013±0.0001 cm²），再CV沉积PB，EDX显示Fe元素沿Pt-B多孔形貌均匀分布，PB膜结构均一（氧化还原峰分离~10 mV）。PB/Pt-B传感器短路模式灵敏度为29±2 μA M^?1（即较纯PB的8.9±0.4 μA M^?1提升约3倍），线性范围相同(1–100 μM)，且在1 mM H₂O₂中电流初值维持≥3.4 h无衰减。PB-NiHCF层叠膜微传感器在短路模式下同样于1 mM H₂O₂连续运行4 h电流无衰减，证明Ag QRE稳定性不限制传感器寿命；Ag QRE在空气中或PBS(pH 7.4)中存储14天电位基本不变。

SECM in short-circuit mode（短路模式下的SECM）

研究人员将PB-NiHCF/Pt-ME与Ag QRE短接，仅用电流表连接，作为SECM探针在恒高度模式(距基底20 μm)下对偏压产生H₂O₂的Pt丝（?0.5 V vs. Ag/AgCl）或Au片（?0.4 V）进行tip-collection模式成像。接近H₂O₂生成区时还原电流显著升高，无偏压基底无信号，对照实验确认特异性。成像后CV验证PB-NiHCF膜完整性保持。短路模式单探头免除对位难题及电极间干扰，且无外加电位不怕探头短暂暴露于空气，操作更安全简便，适合长时间SECM成像。

ATP release detection at alveolar type II cells (ATII)（II型肺泡上皮细胞ATII的ATP释放检测）

在PB/Pt-ME上电聚合含GOx与HEX的聚苯并噁嗪膜制成ATP微生物传感器。原理：溶液中葡萄糖被GOx氧化生成H₂O₂（产生PB还原电流），ATP存在时HEX消耗葡萄糖生成G-6-P，减少H₂O₂生成使阴极电流下降，降幅与ATP浓度成正比。优化PB沉积4圈、BA-TEPA脉冲14次获最高灵敏度91±3 pA μM^?1，检出限9.9±0.3 nM，线性范围0.15–2 μM，动态范围达20 μM，4 °C干燥储存≥1个月稳定。将此传感器置于ATII细胞层上方~20 μm，加葡萄糖基线稳定后用PMA刺激，观察到阴极电流下降约5 pA；加过氧化氢酶(catalase)分解H₂O₂使电流回基线；空白区无细胞对照无此变化。标准加入法估算刺激释放胞外ATP浓度为2.0±0.5 μM，与文献报道一致。

四、结论（翻译与总结讨论）

研究人员在结论中指出：本研究展示了基于PB和PB-NiHCF、工作在短路模式下的先进电化学H₂O₂微传感器的开发。该微传感器具有高选择性——例如超过10倍过量的抗坏血酸才影响微摩尔级H₂O₂的信号，这对生物体系测量至关重要。PB及PB-NiHCF基微传感器在短路模式下的灵敏度和操作稳定性与传统三电极体系相比保持不变。引入多孔Pt-B亚层使灵敏度提高三倍，且PB/Pt-B修饰ME在1 mM H₂O₂溶液中初始电流响应可维持3.4 h。所开发的微（生物）传感器成功应用于SECM绘制H₂O₂生成分布图及检测刺激后ATII细胞的ATP释放。展望未来，可通过在PB膜上固定其他氧化酶来拓展分析物种类。经进一步微型化，此类PB基微（生物）传感器有望用于亚细胞水平代谢活性的局部原位研究。