正常相条件下多糖基手性固定相的化学结构与取代基对大麻素保留行为的影响

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Impact of chemical structure and substituents of polysaccharide-based chiral stationary phases on cannabinoids retention under normal phase conditions

　　

多糖衍生物是分离手性化合物应用最广泛的手性固定相（CSP）。这类CSP具有多种吸附和相互作用位点，这构成了其广泛应用的基础；事实上，它们被视为一种准通用型SP，但与此同时，这也使得对分离过程的完整理解变得困难。在此背景下，本研究旨在加深研究人员对九种商业化多糖基CSP的主链及取代基类型在正相条件下对12种大麻素（包括大麻色烯酸（CBCA）、大麻色烯（CBC）、大麻环萜酚（CBL）和四氢大麻酚（THC）对映体）保留和选择性影响的理解。统计分析方法的应用结果清楚地揭示了含吸电子基团和供电子基团的色谱柱之间存在明显区别，且该区别独立于主链类型。所得信息对于充分利用这些不同取代CSP的潜力以及未来设计新型手性选择剂至关重要。

**研究背景与问题提出**

深入理解分析物、流动相（MP）和固定相（SP）之间的相互作用如何影响色谱保留和分离度，是正相和反相液相色谱以及手性液相色谱领域最重要的挑战之一。分析物的空间构型、流动相组成以及吸附作用、氢键、π-π相互作用和范德华力等在决定特定固定相类型上的保留行为中发挥重要作用。当固定相具有相同主链但取代基不同，或当分析物为结构或光学异构体，或仅因特定取代基团而有所差异时，复杂性进一步增加。

多年来，多种多糖基CSP已被制备。多糖是一类独特的手性选择剂，由于其高对映体识别能力和复杂柔韧的结构。目前有两种不同的主链可供选择，即直链淀粉（amylose）或纤维素（cellulose），可通过添加不同的官能团和取代基（如烷基或卤素）来增强对映识别能力。此外，这些CSP可在多种洗脱条件下运行，包括反相（RP）、正相（NP）、超临界流体色谱（SFC）或极性有机模式（POM）。流动相的本质在决定分析物与固定相之间吸附和相互作用的有利条件是否得以保证方面发挥着深刻作用，在某些情况下甚至导致某些分析物洗脱顺序的反转。尽管有大量研究致力于该主题，多糖衍生物中分子水平的识别机制仍未被完全理解。这一挑战源于这些选择剂的复杂性，它们表现出多样化的相互作用位点和类型。事实上，分析物/固定相上即使在不同位置仅存在一个取代基的有无，都可能显著影响保留，范围从无保留到高度保留的分离。此外，众所周知，两种对映体与手性固定相的相互作用不同，常常导致两种物种的对映识别和对映分离。当待分离或表征的基质中含有光学活性物质时，这一方面至关重要，无论是作为目标物还是杂质。此时，需要对映选择性色谱方法来确保含手性化合物产品的质量和安全性。

大麻（Cannabis sativa L.）中大麻素是其主要生物活性成分，是一个相关的典型例子。大麻素是一类独特的化合物，具有特征的C₂₁（或酸形式的C₂₂）萜酚骨架，在大多数情况下，该骨架有助于形成一个或多个不对称碳。尽管近年来对大麻和火麻提取物及产品的表征兴趣迅速增长，但CSP的使用仍被忽视。事实上，直到最近，痕量的次要的对映体（(+)-Δ⁹-四氢大麻酚）或两种对映体的外消旋或比例混合物（如大麻色烯）才在大麻提取物中被发现，这凸显了对映体表征、对映体纯度和立体稳定性评估的迫切需求。

**研究目的与核心发现**

在前期研究中，研究人员已考察了九种不同取代的多糖基固定相在反相条件下对大麻素保留的影响。本工作旨在进一步评估该组CSP的对映识别能力，通过增加手性分析物的数量，并通过对正相洗脱模式下进行类似实验来补充和比较前期发现。研究人员将阐明流动相对大麻素保留的影响以及不同取代CSP潜在相互作用机制的相似性和差异性，以揭示驱动手性液相色谱中保留和（对映）分离的相互作用力。深入理解该行为对于基于目标分子类别设计具有最佳分离能力的新型CSP、预测分析物保留顺序以及优化分离条件至关重要。该论文发表于《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》。

**关键技术方法**

研究人员采用九种多糖基色谱柱（Chiralpak IA、IB-N、IC、ID、IE、IF、IG、IH、IJ），这些色谱柱以直链淀粉或纤维素为骨架，带有不同取代基（甲基、氯、甲氧基苯基等），化学键合于5 μm全多孔硅胶颗粒上。流动相组成为98/2%（v/v）正己烷/乙醇+0.1%甲酸，等度洗脱。色谱系统为Agilent HPLC 1100，配备二极管阵列检测器（DAD），检测波长228 nm，柱温25°C，流速1 mL/min，进样量5 μL。死时间通过逆尺寸排阻色谱（ISEC）法估算。数据统计分析采用方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验、主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA），使用Minitab统计软件和R语言chemometrics包通过MetaboAnalyst 6.0平台完成。此外，研究人员还使用了一种非精神活性的大麻变种（化学型III，CBD主导型）的真实植物样品进行验证分离。

**研究结果**

**骨架效应的影响**

研究人员比较了相同取代基但不同骨架的CSP：IA（直链淀粉）与IB-N（纤维素）均带有两个供电子基团（-CH₃）；IE（直链淀粉）与IC（纤维素）均带有两个吸电子基团（-Cl）。结果表明，直链淀粉骨架普遍比纤维素骨架产生略大的保留（IA>IB-N，IE>IC），仅CBGA和保留较弱的CBC对映体在IA和IB-N上的保留例外（p>0.05）。直链淀粉骨架的三维构象比纤维素更为无序，后者结构可被描述为薄层状，允许较少相互作用，从而导致较小保留。CBD受骨架性质影响最大，在直链淀粉柱上显示出显著更大的保留。IA柱对对映体识别能力优于IB-N柱，仅THC对映体例外。IE和IC柱则呈现几乎相反的行为，IC柱对CBC和CBL对映体具有更高的对映选择性，而对THC较低。总体而言，IA柱对所有考察的化合物对提供最佳分离度。

**供电子或吸电子取代基的影响**

研究人员考察了取代基类型（供电子或吸电子）和数量的影响，比较了IA/IE（直链淀粉基）、IB-N/IC（纤维素基）以及ID/IE（直链淀粉基）等色谱柱对。结果显示，带有CH₃基团的IA和IB-N的保留因子约为带有Cl基团的IE和IC对应柱的三倍。氯原子对苯基氨基甲酸酯具有钝化效应，减少了N-H和C=O基团上的电子电荷密度，使N-H更易作为氢键供体，而C=O则不易作为氢键受体，这导致较低的结构有序性和分子间相互作用，从而产生较小的保留。比较ID和IE柱发现，仅THC和CBC的保留不受或仅轻微受Cl基团数量影响；而只有一个Cl基团（ID）时，所有其他大麻素的保留显著降低（p<0.05）。有趣的是，ID柱能够区分CBC对映体及其酸性对应物CBCA，而在IE柱中它们几乎共洗脱。

相反，供电子甲基基团使N-H酸性降低，更多参与分子内氢键，一方面使固定相更加规则，另一方面增加了与大麻素的相互作用，几乎独立于选择剂骨架。3,5-二甲基取代CSP的高通用性通过分子动力学已证明其杯状空腔对分析物的最佳适配。

**供电子和吸电子取代基的联合效应**

研究人员通过比较IF和IG柱评估了供电子和吸电子取代基在苯基氨基甲酸酯残基两个不同位置的联合效应。IF和IG分别于3,4位和3,5位用Cl和CH₃双取代。结果表明，IF柱的分离能力低于IG柱。IF柱中CH₃和Cl的邻位位置产生空间位阻，减少了SP苯基氨基甲酸酯残基与大麻素之间的π-π相互作用。IG柱对CBC和CBL对映体显示出统计上更大（p<0.05）的对映选择性值，而对THC较小。值得注意的是，THC对映体在某些CSP上发生洗脱顺序反转，在IA和IB-N柱中(+)-THC先洗脱，而在IE、IF和IG柱中(+)-THC后洗脱。

**不同手性选择剂**

研究人员考察了由不同手性底物制备的IH和IJ柱，分别为直链淀粉三[(S)-α-甲基苄基氨基甲酸酯]和纤维素三(4-甲基苯甲酸酯)。IH和IJ柱提供最佳分离性能，仅CBL对映体在IH柱上未分离。IJ柱对THC和CBL表现出更大的对映选择性，而IH柱对THC/THCA、CBD/CBDA和THCA/CBDA等化合物对具有更高的选择性。CBDA在IH柱上是最保留的大麻素之一，与其他CSP中的行为相反，导致该柱对THCA/CBDA具有最高价选择性。IH柱对THC对映体的洗脱顺序与IA和IB-N相同，而IJ柱则与IE、IF和IG一致。令人惊讶的是，这两根色谱柱显示与大麻素在C18反相柱上的洗脱顺序完全相反。

**综合统计分析**

PCA和HCA对保留因子和选择性值的综合分析表明，CSP可清晰分为三个主要行为组：保留较低的IC/IF/ID/IE紧密聚类；IA/IG对和IB/IJ/IH形成另外两个明确的簇；IB-N柱位于所有三组之间，具有中间过渡位置。该结果进一步验证了不同取代基类型对CSP保留行为的决定性影响。

**正相与反相的比较**

研究人员比较了同一组CSP在正相（本工作）和反相（前期研究）条件下的大麻素保留数据，发现总体保留趋势在两个模式下相同：供电子CH₃基团的CSP（IA、IB-N、IJ）系统性显示比吸电子Cl基团的CSP（IC、ID、IE）更大的保留因子。但洗脱顺序存在差异：反相条件下，所有CSP提供与经典C18柱相似的洗脱顺序，可能表明疏水效应占主导；而IH和IJ柱在正相和反相条件下提供完全相反的洗脱顺序，其正相保留与C18柱完全相反，表明氢键作用在正相条件下占主导。此外，正相条件下所有CSP均能区分CBC对映体（α=1.09–1.64），而反相条件下部分CSP未能实现分离。

**讨论与结论总结**

研究人员通过对九种多糖基CSP的系统研究，揭示了骨架类型和取代基性质对大麻素在正相条件下保留和对映选择性的深刻影响。统计工具的应用增进了对这些复杂CSP中 retention mechanisms 的理解。主要结论包括：（a）仅含吸电子基团（Cl）以及3,4位Cl和CH₃双取代的CSP（IC/ID/IE/IF）聚类在一起，独立于骨架类型，表明相似的保留行为；（b）IA和IG柱（均为直链淀粉基）表现相似，表明苯基部分3位甲基在促进分析物与CSP相互作用中的关键作用；（c）IH和IJ柱提供与反相洗脱模式相反的洗脱顺序，突出氢键型相互作用的主导地位；（d）部分CSP上THC对映体的洗脱顺序发生反转，(+)-THC在IA、IB、IH和ID柱上先洗脱。进一步研究将有助于评估其他对映体（CBC、CBCA、CBL）是否会基于CSP骨架和取代基发生类似过程。

本研究结果虽限于一种化合物系列和单一流动相组成，但有助于根据待分离或纯化的样品以及所需的环境兼容性要求，正确选择柱化学和流动相洗脱模式（正相或反相）。这为全面手性表征大麻样品以及大规模分离单一对映体开辟了新视角。准确的 chirality 分析将为大麻及相关产品的正确标识提供保障，确保产品的可追溯性、安全性和质量。