综述：胶质瘤干细胞中DNA损伤反应可塑性的分子认识

《Communications Biology》：Molecular insights into DNA damage response plasticity in glioma stem cells

　　

高级别胶质瘤在放疗和替莫唑胺治疗后频繁复发，原因是肿瘤细胞能够适应持续性DNA损伤。本综述讨论了胶质瘤干细胞如何通过重新编程DNA损伤反应（DDR）而非单纯提高DNA修复效率来促进这种抵抗性。研究人员检查了检查点信号、复制应激耐受、DNA修复通路选择、染色质及RNA调控、翻译控制、代谢和微环境信号如何协同作用，以在基因毒性应激下维持生存。通过整合这些机制，研究人员将DNA损伤反应可塑性（DDR plasticity）定义为支持肿瘤持续存在和复发的适应性网络，同时揭示了一些可能指导更有效治疗策略的脆弱点。

当前DNA修复靶向治疗
高级别胶质瘤（HGGs）的当前标准治疗主要基于DNA损伤策略。放疗主要诱导DNA双链断裂和氧化碱基损伤，而替莫唑胺（TMZ）在多个DNA位点引入甲基加合物，包括N7-鸟嘌呤、O3-腺嘌呤以及临床最相关的O6-鸟嘌呤。TMZ的细胞毒性依赖于不成功的损伤处理，导致复制应激、链断裂积累和凋亡。然而，TMZ抵抗常通过增强DNA修复、损伤耐受或凋亡抑制而产生。在复发情况下，其他烷化剂如洛莫司汀和丙卡巴肼常单独或联合使用（如PCV方案）。洛莫司汀是一种高脂溶性的氯乙基化剂，易透过血脑屏障，诱导DNA和RNA烷基化以及鸟嘌呤O6位点的链间交联，而丙卡巴肼同样作用于O6-鸟嘌呤甲基化。其疗效同样受限于胶质瘤细胞耐受和修复烷化损伤的能力。这些观察表明，临床失败并非由于DNA损伤诱导不足，而是由临床相关分子标志物塑造的适应性DNA损伤反应和修复程序造成的。重要的是，这种韧性富集于表现更高生存可塑性的特定肿瘤细胞亚群中。在此背景下，胶质瘤干细胞（GSCs）已成为治疗抵抗和肿瘤复发的核心驱动因素，解释了为何DNA损伤治疗无法实现持久疾病控制。

胶质瘤干细胞
GSCs被认为是胶质瘤发生、进展、治疗抵抗和复发的关键驱动因素。早期研究通过富集CD133⁺细胞鉴定了肿瘤起始群体；然而，CD133^?组分也能保留肿瘤起始能力，表明干性不能由单一标志物定义。因此，多种表面标志物与GSC群体相关，包括CD44、CD15、A2B5、CD90、整合素α6、CD171/L1CAM和EpCAM，其过表达识别出高度致瘤且治疗抵抗的胶质母细胞瘤（GBM）亚群。除表面表型外，干细胞样状态由与神经祖细胞特性和自我更新相关的转录和表观遗传程序定义，包括BMI1、SOX2、MSI1/2、NANOG和巢蛋白（Nestin），以及YAP/TAZ信号。干性也具有高度可塑性：在治疗适应型GBM细胞中，OCT4再激活促进干细胞样程序、代谢重编程和应激生存，凸显了GSC状态的可逆性。一致地，由OCT4、SOX2、SALL2和OLIG2组成的核心转录网络足以将分化型GBM细胞重编程为诱导型GSC（induced GSC），其保留自我更新、肿瘤起始能力和治疗抵抗。在体内，GSCs富集于解剖学生态位如脑室下区，该处的生态位来源信号支持干性、治疗抵抗和复发。这些发现表明GSCs代表一种动态且可塑的状态，其适应能力是其耐受基因毒性应激的基础，为以DDR为中心的治疗抵抗机制奠定了基础。

GSCs治疗抵抗的临床和生物学基础
早在GSCs被分子定义之前，临床观察就提示恶性胶质瘤的治疗反应不能仅由组织学、肿瘤大小、解剖位置或治疗强度解释。在一项开创性研究中，Rosenblum等人表明年轻患者术后生存期显著长于老年患者，尽管临床特征相似，他们将这种差异归因于克隆形成肿瘤细胞对亚硝脲类BCNU的内在化学敏感性增加，而非肿瘤侵袭性降低。重要的是，生存期与化疗后体外克隆形成存活率呈负相关。这些发现提供了早期证据，表明治疗抵抗编码于特定肿瘤细胞亚群中，预示着后来在HGGs中鉴定出干细胞样、治疗抵抗的区室。因此，GSCs可被视为临床观察到的治疗反应和疾病进展异质性的细胞基础。后续研究表明，GSC的韧性不仅反映了增强的DNA修复，更是一种高度可塑的DDR状态，其中检查点控制、复制应激耐受和细胞命运决定被重新编程以在基因毒性应激下维持生存。综合来看，这些相互关联的机制定义了GSCs中多层适应性DNA损伤反应框架，是治疗抵抗的基础。因此，DDR可塑性成为GSCs的定义性特征和HGG治疗抵抗的核心驱动因素。近期的单细胞和空间转录组研究进一步揭示，胶质母细胞瘤由动态的恶性细胞状态和空间组织的生态系统组成，而非单一的固定细胞层次。尽管不特异于GSCs，但这些发现支持一个模型，即干细胞样肿瘤维持状态是异质性、可诱导且背景依赖性的。一致地，以GSC为重点的研究显示，干细胞样细胞占据不同的转录状态和生态位，表明DDR可塑性受转录身份、微环境线索和治疗压力的塑造。因此，下面讨论的机制被组织成两个互补层面：核心检查点和DNA修复通路，以及维持GSCs适应性DDR能力的更广泛调控层。因此，一些信号节点在不同节段中重复出现，因为它们在不同生物学背景下被重新部署。

检查点信号与复制应激
GSCs日益被认为是通过加强DDR信号和过度活跃的细胞周期检查点来维持的肿瘤传播状态，构成了放化疗抵抗的核心轴。开创性研究表明，照射后，GSCs快速且持续地激活ATM/ATR-Chk1/Chk2级联反应，强制执行强大的G2/M检查点，并比分化型胶质瘤细胞更有效地解决DNA双链断裂（DSBs）。这一表型反映的是检查点过度激活和复制减慢，而非本质上更优越的修复能力，从而实现了延长损伤耐受和延迟细胞周期转变。药理性ATM抑制可恢复对DSB诱导剂的敏感性，支持检查点强化作为GSC生存的核心。这一状态的关键驱动因素是慢性内源性复制应激。GSCs表现出降低的复制叉速度、复制位点γH2AX/53BP1积累，以及由长神经基因转录驱动的RNA-DNA杂交体升高。这种应激并非导致复制叉崩溃，而是维持ATR-Chk1信号和检查点成瘾，赋予放射抵抗性，但同时也暴露了脆弱性，因为联合ATR/PARP抑制可在体内外消除自我更新。CDK12/CDK13抑制同样破坏GBM中的转录延伸和复制叉进展，将转录-复制冲突与检查点依赖性生存联系起来，而PARG抑制在GSCs中以NAD⁺依赖性方式诱导复制停滞、S期检查点激活和凋亡，将复制应激缓冲确定为可靶向的依赖性。多种缓冲系统进一步支持对复制相关损伤的耐受。端粒完整性构成一个主要的DDR节点：G-四链体配体端粒抑素（telomestatin）在GSCs中诱导端粒功能障碍，触发ATR-Chk1激活和复制依赖性死亡，同时保留非干细胞肿瘤细胞。复制相关拓扑应力的解决依赖于拓扑异构酶IIβ（TOP2β）；其耗竭使GSCs对TMZ和烷化应激敏感，将其反应转向分化细胞。复制蛋白A（RPA）过表达同样支持GSC生存，其抑制导致DSB积累和放射敏感化，突显了对叉保护而非损伤移除的依赖性。其他工作表明检查点保护受上游信号调节，IGF1R促进放射抵抗性，CDC20扰动增加治疗敏感性，进一步将检查点功能与更广泛的生存和细胞周期网络联系起来。在这一以检查点为主导的景观中，经典修复通路在时间上被重塑以维持损伤耐受。范可尼贫血（Fanconi anemia）通路激活的延迟和对同源重组（HR）的差异依赖性（包括RAD51和FA组分）允许延长G2期阻滞并在未解决损伤的情况下生存。端粒相关DDR进一步强化这一状态：ALT阳性GSCs维持慢性端粒损伤信号同时保持染色体稳定性，支持长期存续。2D和3D GSC模型中的临床前研究支持这种检查点成瘾状态的治疗相关性，而改变放射剂量（包括超高剂量率照射）进一步支持了检查点稳健性的背景依赖性。总之，这些研究将GSC抵抗定义为一种复制应激驱动的、检查点成瘾的DDR状态，关键依赖于持续的ATR/Chk1信号、叉保护、端粒完整性和修复通路的延迟参与。因此，检查点强化应被视为一种损伤耐受机制，而非优越修复的标志，其在持续基因毒性应激下维持GSC生存。

DDR可塑性与适应性生存程序
除检查点成瘾和复制应激依赖性外，GSCs在DDR输出方面表现出深刻的可塑性。DNA损伤感知保持完整，而检查点执行、凋亡和分化被选择性削弱，将DDR转化为由致癌、炎症、生态位来源和治疗诱导信号塑造的允许性生存程序。自分泌生态位样信号是调节DDR的主要机制。EDN3-EDNRB轴在应激下维持未分化、抗凋亡和克隆形成的GSC状态；破坏该轴可消除自我更新和致瘤性，表明以生存为导向的DDR调节维持复发。炎症信号进一步将DDR激活与肿瘤抑制脱钩：长期IL-1β诱导氧化性DNA损伤和DDR信号，而COX-2抑制p53，在慢性基因毒性应激下禁用凋亡和检查点阻滞。小动脉周围和工程化血管周围生态位同样强化GSC富集和放射抵抗性，表明生态位依赖性适应性DDR状态的稳定。层粘连蛋白α2依赖性粘附同样支持干细胞维持和应激耐受。致癌和粘附依赖性通路进一步调节DDR输出。L1CAM通过NBS1调节MRN-ATM-Chk2轴，将侵袭特征与核基因组监测联系起来。MET高表达的GSCs表现出ATM、Chk2和RAD51激活升高以及胞质抗凋亡p21；MET抑制损害DSB修复并恢复放射敏感性。整合素α6在分次放疗后变得不可或缺，支持DSB修复和生存。不同的TMZ暴露条件也驱动不同的抵抗状态，表明DDR可塑性是剂量依赖性的。有丝分裂控制、代谢状态和翻译后修饰进一步强化检查点容许性。MELK通过FOXM1-Aurora B和ATM/ATR信号维持染色体完整性，其抑制导致有丝分裂灾难和放射敏感化。PDK1与Chk1协同维持G2/M控制，双重靶向（类似UCN-01的作用）触发灾难性检查点崩溃。氯喹同样强调了这种平衡的背景依赖性，因为它同时激活GSCs中的促生存和死亡诱导信号。DDR的代谢支持也至关重要：升高的糖酵解维持检查点和HR信号，而GAPDH抑制破坏ATM/Chk激活并诱导基因组碎片化。去泛素化酶USP1稳定ID1和CHEK1，维持干细胞样身份和检查点信号；USP1抑制增强辐射诱导的DNA损伤并在体内改善生存。同样，PAF/KIAA0101促进易错跨损伤合成（TLS）和放射抵抗性自我更新；其耗竭或TLS抑制减少球形成并增强细胞对放射的敏感性。这些适应性DDR状态越来越多地被用于治疗利用。ATR抑制与TMZ在MGMT甲基化细胞中协同作用，增加γH2AX、凋亡和克隆形成丧失。癌-睾丸lncRNA PITAR通过稳定TRIM28并促进p53降解来促进适应性重编程，而PITAR敲低恢复p53信号并增敏细胞对TMZ。多靶点方法强化了这一概念：脑渗透性Hsp90抑制剂NXD30001抑制自我更新同时削弱DDR和内质网应激，并与放疗协同；三氧化二砷联合(-)-棉酚下调DDR基因并离体选择性杀死GSCs。天然产物taccaoside A通过抑制HRAS/KRAS-PI3K-AKT和MAPK-ERK通路，靶向支持DDR的致癌信号，在体内诱导凋亡和干性丧失。其他方法，包括一氧化氮、PBI-05204和oHSV-P10，同样通过不直接靶向修复酶的方式破坏适应性生存状态。放射生物学背景进一步塑造DDR可塑性。总放射剂量而非剂量率决定反应，而质子束通过诱导过量ROS和DDR崩溃优于光子。靶向放射药理学策略可覆盖静止状态：Sonic Hedgehog激活迫使休眠细胞进入S期，使[I-125]ITdU掺入成为可能，并选择性消除GSC群体。生物学治疗直接利用DDR重编程：oHSV-G47Δ与TMZ隔离ATM并抑制ATR信号；oHSV-TRAIL在复发肿瘤中诱导强效凋亡；细小病毒MVM优先在p53改变的GSCs中复制，在体内引发DDR依赖性旁系损伤。Src信号抑制（AZD0530）通过阻断辐射诱导的Src激活进一步增强胶质瘤细胞的放射敏感性。先进的肿瘤模型进一步强调了DDR异质性和适应性。患者源性细胞系的谱分析揭示了复发性驱动突变和具有预后意义的DDR富集转录簇。联合Nbs1/p53丢失产生高度不稳定的胶质瘤，类似于儿童和放疗后肿瘤。三维平台进一步显示肿瘤电场治疗与TMZ和PARP抑制剂协同作用，独立于p53或MGMT状态，降低BRCA1水平并损害DNA修复。与此同时，ALT胶质瘤模型进一步支持对持续性、非致死性基因组维持状态的耐受。总之，这些研究将DDR可塑性确立为GSCs中一个核心的多层生存程序，其中信号、微环境线索和应激适应反应动态重塑DDR输出，以利于在基因毒性应激下的持续存在。

化学放疗抵抗中的直接逆转和碱基切除修复
在检查点激活和复制应激耐受的下游，GSCs依赖直接逆转和碱基切除修复（BER）来应对烷化诱导的DNA损伤。MGMT介导的O6-甲基鸟嘌呤损伤逆转和PARP依赖的BER关键地缓冲了TMZ和放疗的细胞毒性作用，维持了基因毒性应激下的克隆形成生存。PARP1抑制破坏BER并将可修复损伤转化为MGMT依赖性复制相关DSBs。MGMT本身仍是治疗反应的中心决定因素：I型干扰素通过NF-κB抑制抑制MGMT转录；PRIMA-1^MET以p53非依赖性方式降低MGMT表达和干性；缺氧同时增强MGMT水平和干细胞样特性。一致地，MEK-ERK信号通过MDM2-p53轴同样维持MGMT表达和替莫唑胺抵抗，将MGMT调节与致癌信号联系起来。相反，飞燕草苷通过抑制NF-κB驱动的MGMT转录并与TMZ协同作用，尤其是在间充质GSC群体中。治疗性MGMT阻断也可通过靶向递送策略实现，如仿生共递送TMZ与MGMT抑制剂抑制原位胶质母细胞瘤生长，支持直接逆转作为可靶向脆弱性。MGMT靶向还通过延长γH2AX持续存在并促进放射后有丝分裂灾难而放射致敏GSCs。纳米颗粒介导的药物抵抗程序沉默同样延长原位胶质母细胞瘤模型中的生存。复制相关缓冲机制与直接逆转和BER在功能上交织。端粒抑素选择性诱导GSCs中端粒功能障碍和ATR-Chk1过度激活，引发复制依赖性停滞和死亡。复制相关拓扑应力的解决依赖于拓扑异构酶IIβ，其耗竭使GSCs对TMZ和烷化剂敏感，而RPA抑制导致广泛DSB积累和放射敏感化。一致地，PARP抑制（talazoparib）显著增强放射敏感性，特别是高LET碳离子，通过阻止DSB解决和强制持久G2/M阻滞。在此背景下，ATR-Chk1信号成为关键的补偿性依赖性，ATR抑制与TMZ在MGMT甲基化GSCs中特异性协同。BER中心防御进一步受缺氧调节，如lncRNA LUCAT1在缺氧GSCs中调节DDR输出。细胞状态和微环境进一步调节这些以修复为中心的防御。由RB丢失、KRAS激活和PTEN失活驱动的去分化产生干细胞样、MGMT阳性的TMZ抗性表型，而靠近脑室下区起源的肿瘤表现出富集干性程序、升高的MGMT信号和较差预后。治疗策略越来越多地利用这些脆弱性：双重ALKBH2/ALKBH5抑制逆转TMZ抵抗并降低MGMT表达。肿瘤电场治疗使GSCs对PARP抑制和TMZ敏感，独立于p53和MGMT状态；PDCD10丢失促进MGMT上调及TMZ耐受；分化疗法（全反式维甲酸）下调MGMT和干性，恢复TMZ敏感性。Oltipraz在胶质母细胞瘤中也显示出抗肿瘤活性，但其与MGMT或BER的联系似乎是间接的。总之，这些研究表明直接逆转和BER在一个更广泛的复制应激适应网络中运作，其中MGMT调节、PARP活性和叉保护维持治疗抵抗。因此，靶向这些相互连接的层可能瓦解HGG中以修复为中心的防御，将BER和直接逆转定位为更广泛适应性DDR网络中的近端缓冲层。

同源重组动态
在检查点成瘾和复制应激耐受之后，同源重组（HR）成为治疗反应异质性的关键决定因素。在GSCs中，HR涵盖从缺陷、基因组不稳定状态到RAD51依赖性HR成瘾表型的连续谱。早期证据表明并非所有GSCs都具有放射抵抗性：CD133⁺群体可能表现出受损的HR和不完全的检查点激活，导致放射敏感性和染色体不稳定性。然而，后续研究主要鉴定了增强的HR状态。RAD51在放射抵抗性GSCs中持续上调，并受放射进一步诱导；其药理学抑制（RI-1、B02）抑制RAD51焦点形成，破坏HR，诱导持久DSBs和凋亡，并选择性抑制克隆形成存活，同时保留正常神经干细胞。临床上，高RAD51表达与较差反应和较短无进展生存期相关。这种HR依赖性由汇聚的转录和调节回路维持。STAT3依赖的FOXM1信号转录控制核心HR基因，其抑制增加γH2AX，损害HR并诱导有丝分裂灾难。lncRNA DARS1-AS1通过YBX1稳定FOXM1、RAD51和BRCA1转录本，维持HR和肿瘤生长；其耗竭在体内放射致敏GSCs。BRCA1本身在p53野生型GSCs中调节TMZ反应，其敲低抑制HR激活并增加凋亡。PRMT5抑制同样损害范可尼贫血通路介导的HR并增强替莫唑胺疗效，支持FA/HR相关修复依赖性作为可靶向脆弱性。同样，MEOX2通过PARP1相互作用促进胶质母细胞瘤干细胞样细胞中的DNA修复和治疗抵抗，表明HR能力依赖于更广泛的调控网络，而不仅是RAD51丰度。HR成瘾在治疗上是可开发的。青蒿琥酯通过抑制RAD51和HR与TMZ协同作用，而不增加原发性DSB负担。溶瘤HSV联合PARP抑制诱导RAD51和CHK1的蛋白酶体降解，在GSCs中选择性引起大量DSB积累和凋亡；RAD51敲低表型模拟PARP抑制剂敏感性，证实HR破坏为合成致死驱动因素。相反，对PARP抑制的抵抗可通过Myc-CDK18-ATR轴产生：Myc扩增细胞表现出HR缺陷、PARP抑制剂敏感状态，而CDK18驱动的ATR激活在非扩增细胞中恢复HR；抑制CDK18或ATR可重新敏化这些群体。与此一致，脂质代谢调节也反馈到HR相关修复中，如SCD1和SCD5通过脂肪酸去饱和调节PARP依赖性DNA修复。HR调节进一步整合染色质和应激适应通路。延伸因子SPT6维持BRCA1和RAD51表达；其抑制抑制HR，诱导G2期阻滞、多倍体化和致瘤性丧失。RECQL4耗竭破坏HR，激活检查点信号，并使GSCs对TMZ敏感。端粒导向的应激也与这一回路交叉，因为G-四链体稳定强加与GSC生存不相容的复制相关应激。代谢和内质网应激信号通过SCD1汇聚于HR，SCD1在IRE1-SREBP1下游维持RAD51表达；其抑制诱导持久DNA损伤和近乎完全的GSCs耗竭。在3D培养中，VEGF-Akt信号促进HR和DNA-PKcs激活，而其抑制导致持久γH2AX积累和放射敏感化。分子伴侣HSP90稳定RAD51和CHK1；onalespib介导两种蛋白的降解消除HR并增强放化疗敏感性。最后，翻译后和表观转录调节因子强化HR能力。UCHL3-POLD4轴稳定复制聚合酶POLD4，维持HR/NHEJ和放射抵抗，而MST4-USP14-ALKBH5模块通过m⁶A依赖性稳定保留RAD51表达；其破坏损害HR并放射致敏GSCs。体内遗传建模（RCAS-TVA-CRISPR系统）进一步能够在胶质瘤演进过程中功能解剖HR依赖性和合成致死脆弱性。总之，这些研究将HR定义为从HR缺陷到HR成瘾状态的动态调节脆弱性。在整个谱系中，以RAD51为中心的HR网络与转录、代谢和应激反应通路整合，代表HGG治疗抵抗的中心可靶向轴。

DNA-PK依赖性末端连接
同源重组（HR）定义了增殖性GSCs中的主要抵抗轴，而非同源末端连接（NHEJ）则在复制应激、静止和急性照射下提供了互补且常占主导的生存策略。在GSCs中，由DNA-PKcs和XRCC4介导的快速、细胞周期非依赖性DSB修复使得基因毒性应激后得以生存，但代价是增加的致突变耐受。多项研究表明GSCs对DNA-PK驱动的NHEJ有选择性依赖。DNA-PKcs耗竭损害DSB修复，并通过mTOR抑制将受损细胞重定向至LC3-Beclin-1依赖性自噬细胞死亡，机械地将缺陷NHEJ与自噬脆弱性联系起来。一致地，时间性DNA-PK激活已被证明驱动GSCs中的基因组不稳定性和治疗抵抗，支持持续性NHEJ信号以基因组完整性为代价促进生存的观点。组织蛋白酶L耗竭同样增强体内外放射敏感性，进一步支持NHEJ连接的应激耐受作为治疗可靶向依赖性。一致地，NHEJ相较于凋亡信号的主导地位以及在静止中的持久性是暴露于基因毒性应激的GSCs的定义性特征。这种依赖性受到致癌信号的紧密调节。Akt抑制通过降低DNA-PKcs水平并削弱NHEJ介导的DSB修复，显著放射致敏GBM细胞，特别是那些携带突变或缺失TP53的细胞。在野生型细胞中沉默TP53表型模拟这种脆弱性，表明TP53丢失强制补偿性依赖PI3K-Akt-NHEJ信号。联合Akt和DNA-PKcs抑制甚至可放射致敏p53功能完好的细胞，支持该轴的协同靶向。这种回路的直接药理学利用体现在EGFR导向的combi分子ZR2002上，它抑制EGFR/Erk/Akt信号同时诱导DNA损伤，并选择性地在体内以p53依赖性方式消除TMZ抵抗、EGFRvIII阳性的GSCs。这一概念由ZYH005强化，它在胶质母细胞瘤中间样耦合EGFR靶向与DNA损伤诱导和有丝分裂灾难。空间背景进一步塑造NHEJ依赖性。在3D GSC模型中，VEGF-Akt信号激活DNA-PKcs并维持NHEJ和HR；VEGF剥夺废除这些通路，诱导持久γH2AX和pDNA-PKcs焦点，并引发有丝分裂灾难和深度放射敏感化。Akt抑制在2D和3D系统中均重现这些效应，改善体内生存。翻译后调节将NHEJ与干性和可塑性整合。在间充质GSCs中，UCHL3-POLD4轴稳定聚合酶δ，支持高效NHEJ和HR、自我更新及致瘤性；其破坏诱导持久DSBs、干性丧失和强效放射敏感化。转录相关修复支架进一步强化NHEJ功能。AATF在GSCs中上调，在复制叉处结合并稳定XRCC4；DNA损伤后，ATM依赖性磷酸化释放XRCC4以实现DSB修复。破坏这一相互作用损害NHEJ，增加未修复损伤和凋亡，并使肿瘤对放化疗敏感。总之，这些研究确立了DNA-PKcs和XRCC4依赖性NHEJ作为GSCs中占主导的、可药用的生存通路，其与致癌信号和生态位线索协同作用以维持DSB修复和应激耐受。

PI3K/Akt信号作为干性和DDR适应的上游调节因子
PI3K/Akt通路是GSCs中最持续激活的生存程序之一，它主要作为干性相关生存的上游调节因子而非直接DNA修复通路发挥作用。通过整合促有丝分裂、代谢和应激适应信号，Akt建立了一个允许性背景，GSCs在此背景下抑制凋亡并支持基因毒性应激后的恢复。因此，PI3K/Akt信号充当干性与DDR适应之间的耦合层。这一观点进一步得到以下研究的支持：药理学抑制VEGF/PI3K/Akt信号或双重PI3K/mTOR阻断足以在GSCs中诱导细胞周期阻滞、凋亡和放射敏感化，与其在维持适应性生存状态而非直接执行DNA修复中的作用一致。Notch信号提供了Akt依赖性放射抵抗的原型实例。照射后，Notch激活通过参与PI3K/Akt并调节抗凋亡与促凋亡Mcl-1亚型来促进GSC生存，而不增加内在DNA修复能力。使用γ-分泌酶抑制剂的药理学Notch抑制选择性放射致敏CD133⁺干细胞样群体，同时保留正常神经细胞，凸显了GSC对该轴的特异性依赖。GSCs还通过独特的自分泌鞘氨醇-1-磷酸（S1P）循环维持Akt激活。与正常神经细胞不同，GSCs组成性产生并分泌S1P，激活S1P1-Akt信号以维持基因毒性应激下的生存。该信号限制了DSB积累，即使在MGMT介导的修复受损时也支持活力，将S1P确定为Akt驱动抵抗的关键上游调节因子。PI3K/Akt信号的破坏暴露了明显的脆弱性。热疗阻止辐射诱导的Akt激活，消除自我更新，诱导持久DSBs和凋亡，并抑制肿瘤生长。在体内，联合热疗-放疗显著延长生存期，其中Akt抑制驱动放射敏感化。近期工作进一步将这一概念扩展到Akt信号的上游和下游：PTEN再激活通过破坏胞质铁硫簇组装损害GSCs；而脑靶向共递送奥希替尼和硼替佐米在分化指导的治疗背景中抑制放射抵抗性胶质母细胞瘤，支持PI3K/Akt调节的抵抗状态的可处理性。总之，这些研究表明PI3K/Akt信号并非主要增强DNA修复，而是维持干细胞样生存状态，在此状态下可部署适应性DDR程序。因此，靶向该通路可能是瓦解肿瘤维持性GSCs的适应性生存状态所必需的。

干性和DDR能力的表观遗传和表观转录调控
表观遗传和表观转录调控是GSCs中DDR能力和治疗抵抗的核心决定因素。通过协调染色质结构、组蛋白修饰、DNA/RNA甲基化和蛋白质稳定性的控制，GSCs建立了一个可塑的调节景观，在基因毒性应激下强化DNA修复和适应性生存。因此，染色质和RNA介导的机制代表DDR调控的互补层。破坏这些回路可能使适应性DDR状态不稳定。RNA甲基化已成为一个主要的调控层。METTL3依赖性m⁶A甲基化在GSCs中高度富集，并通过3′UTR修饰稳定SOX2 mRNA，维持干性和放射抵抗；METTL3耗竭减少神经球形成，增加γH2AX持久性，并放射致敏GSCs，这些效应可由缺少被调控的3′UTR的SOX2挽救。METTL3还通过稳定MGMT和APNG转录本促进化学抵抗，在体内外降低TMZ敏感性。全基因组DNA和RNA甲基化模式进一步将GSCs与正常神经干细胞区分开来。GSCs表现出降低的5mC/5hmC、增加的5fC/5caC、异常的TET活性以及与增殖和治疗耐受相关的增强子重塑。TET2过表达支持干性维持和DNA修复效率，暗示TET依赖性氧化程序在治疗下生存。m⁶A去甲基化酶提供DDR调控的额外层次。m⁶A去甲基化酶FTO促进GSCs中的放射抵抗和干性维持，支持可逆RNA甲基化作为DDR适应的调节因子。同样，在GSCs中高表达的ALKBH5通过调节CHEK1、RAD51和其他HR基因维持HR能力，促进放射抵抗和侵袭；其抑制放射致敏GSCs并在3D模型中抑制生长。在翻译后水平，MST4-USP14-ALKBH5轴防止泛素介导的ALKBH5降解，保留RAD51表达和HR能力；该通路的破坏诱导持久DNA损伤、凋亡和放射敏感化。组蛋白修饰酶也关键地塑造DDR结果。在GSCs中过表达的赖氨酸去甲基化酶KDM1A/LSD1转录激活HR和NHEJ基因，包括BRCA1、RAD51和FOXM1；其抑制抑制DSB修复，增加γH2AX积累，降低干性，并在体内使GSCs对TMZ敏感。类似地，KDM2B支持胶质瘤干细胞样细胞生存和化学抵抗，将组蛋白去甲基化酶的作用扩展到LSD1之外，形成一个保存抵抗性干细胞样状态的更广泛表观遗传框架。同样，G9a/GLP抑制通过诱导凋亡和自噬使胶质瘤细胞和GSC富集的神经球对TMZ敏感，独立于MGMT启动子甲基化或干性基因表达，将G9a确定为跨GBM细胞状态的广泛表观遗传脆弱性。HDAC6通过SHH/Gli1抑制促进GSC分化和放射敏感性，进一步将干性维持与DDR能力联系起来。临床相关信号进一步与表观遗传DDR调控交叉。地塞米松诱导CEBPB驱动的转录程序，增强增殖、生存和TMZ抵抗，伴有DNA修复基因如XRCC2和BRCA2的上调。这种间充质修复胜任状态可被喜树碱拮抗，表明类固醇暴露可能强化DDR胜任状态。电离辐射本身也可通过调节MYC和NBN表达重塑该层，表明治疗诱导的转录反应反馈到表观遗传控制的DNA修复程序中。肿瘤抑制因子的表观遗传再激活也调节治疗反应。DNA甲基化抑制剂5-阿扎胞苷恢复TUSC3表达，降低干性并重新使GSCs对TMZ敏感，独立于MGMT状态；在MGMT非甲基化细胞系中，与lomeguatrib组合可实现强力肿瘤抑制。最后，高阶染色质组织直接将炎症信号与DDR耦合。NUP98作为染色质支架通过与NF-κB（p65/RelA）相互作用，维持核心HR因子（包括BRCA1/2、RAD51、RAD54L、BLM和XRCC2）的转录。NUP98耗竭瓦解HR能力，增加照射后凋亡，降低干性，并使肿瘤对放化疗敏感，将NUP98-NF-κB确定为基于染色质的DDR枢纽。同时，miR-128介导的Polycomb抑制复合物靶向进一步表明非编码RNA网络表观遗传地限制干细胞样程序。总之，这些研究将表观遗传和表观转录调控确立为协调GSCs中DDR能力的主要层次。因此，靶向RNA甲基化、组蛋白修饰因子、染色质支架和蛋白质稳定性回路可能使治疗难治性GSC状态失稳。

RNA剪接作为干性和DDR能力之间的转录后连接
在表观遗传调控的基础上，RNA剪接作为转录后层次出现，GSCs通过该层次精细调节干性和DDR能力。剪接体完整性和可变剪接的改变直接塑造DNA修复和致癌信号网络。剪接体组分SNRPB在GBM和患者源性GSCs中过表达，高表达与不良预后相关。SNRPB敲低诱导凋亡和广泛的剪接破坏，包括内含子保留以及涉及RNA加工、染色质重塑、HR和DNA修复的基因下调。受影响的通路包括RTK、PI3K-AKT、RAS/MAPK、RB和p53，表明剪接体完整性是维持DDR胜任干细胞样程序所必需的。剪接调控也构成了GSC亚型间功能异质性的基础。对原神经型和间充质型GSCs的比较分析鉴定出约4900个差异剪接事件，体外模型与患者肿瘤之间具有强一致性。间充质型GSCs优先表现出DNA修复和细胞周期基因（ERCC1、FANCD2、RAD17）的可变剪接，以及预后相关lncRNA（CRNDE、MYOSLID、SOX21-AS1）表达增加，与增强的放射抵抗性相关。更广泛地，核心剪接体功能之外的转录后RNA调控也促进抵抗性干细胞样状态，如miR-146b-5p和原神经性miRNA程序调节GSCs中的干性和治疗反应。总之，这些发现表明异常RNA剪接直接导致干细胞样胶质瘤状态中DDR能力的获得和维持。这支持剪接体相关调节因子作为HGG中的治疗脆弱性。

DDR能力的翻译控制
在检查点激活和修复通路选择之外，GSCs高度依赖翻译控制在基因毒性应激后维持DDR信号。照射后，短寿命修复和检查点蛋白的快速补充成为限速步骤，使蛋白质合成成为生存的关键决定因素。近期的翻译组层面分析进一步支持mRNA翻译在适应性胶质母细胞瘤生物学中的主要作用。mTOR通路是这种依赖性的核心。双重mTORC1/2抑制（AZD2014，Vistusertib）通过抑制eIF4E/4E-BP1依赖性帽依赖翻译的DDR蛋白，损害照射后恢复，导致持久γH2AX和延迟DSB解决。多核糖体谱分析证实GSCs中的辐射反应主要在翻译水平受到调节：INK128破坏eIF4F组装，延长DNA损伤信号，改变细胞器重塑，并显著放射致敏GSCs。代谢输入汇聚于该轴。G0S2在放射抵抗性GSCs和复发性GBM中上调，通过RNF168抑制激活mTOR-S6K信号并稳定53BP1，促进高效DSB修复。靶向G0S2破坏翻译信号，增加DNA损伤，并恢复放射敏感性。翻译依赖性进一步通过核糖体生物发生的控制得到强化。XPO1抑制（selinexor）阻断5S和18S rRNA的核输出，抑制多核糖体形成，并阻止必需DDR蛋白的合成。与照射联合，selinexor诱导持久γH2AX、未修复DSBs，并在原位模型中显著延长生存，同时保留正常神经组织。同时，外在核糖体刺激可驱动胶质瘤细胞向干细胞样状态转化，支持核糖体连接的翻译控制在维持DDR胜任干细胞样状态中的作用。总之，这些研究将翻译控制置于干性相关生存回路的下游和修复执行的上游，将其确定为适应性DDR能力的系统层面决定因素。这暴露了一个更广泛的脆弱性，可用于克服GSCs中的放射抵抗。

代谢重编程与DDR支持
GSCs中有效的DDR执行与代谢适应性紧密耦合。代谢重编程提供了适应性DDR状态在治疗下所需的能量、氧化还原和生物合成条件。早期研究表明，抵抗性GSCs采用热量限制样代谢状态，其特征是糖酵解降低、β-氧化增强以及组成性AMPK/SIRT1-PGC-1α激活，促进自噬和DDR强化。破坏这种状态使GSCs敏感化：白藜芦醇联合照射在体内抑制克隆形成并损害DSB修复；而D609引起的ATP耗竭独立于直接DNA损伤触发GSC死亡。一致地，3-acetonyltabersonine损害线粒体适应性，通过诱导线粒体去极化、抑制ATM信号和损害损伤后恢复选择性杀死GSCs。CRISPRi筛选进一步将代谢应激反应与胶质母细胞瘤中的化学抵抗程序联系起来。代谢-DDR耦合也通过氧化应激和脂质信号出现。化合物NEO100诱导内质网应激和凋亡，同时抑制侵袭并延长生存。EGFR扩增的GSCs，以慢性ROS和升高的基线DDR为特征，表现出对PARP1的选择性依赖以及对talazoparib的极高敏感性。在群体水平，NRF2维持抗氧化防御和干性；其耗竭增加氧化应激并放射致敏GSCs对光子和碳离子。分子伴侣介导的自噬进一步通过与代谢-DDR耦合交叉，促进IDH1等酶的降解，将自噬与代谢-DDR调节联系起来。直接代谢控制DNA修复最近被揭示。ALDH1A3驱动糖酵解通量和乳酸依赖性XRCC1乳酰化，在TMZ和放射下促进BER/NHEJ；破坏ALDH1A3-PKM2相互作用恢复化学敏感性。同样，PHGDH依赖性丝氨酸合成维持一碳代谢、核苷酸供应和HR能力；在PDX模型中，PHGDH抑制增加ROS和DSBs并与放射协同。PGK1/PHGDH轴同样驱动GSCs中的放射抵抗，强化代谢对DDR能力的支持。脂质代谢也直接调节修复能力：从头脂质合成支持DNA修复，而其抑制损害DDR；脂滴形成抗衡PARP抑制。微环境和治疗相关因素进一步塑造代谢DDR状态。脑室周围GSC生态位表现出增强的干性和DNA修复信号，而MRSI定义的GSC富集区域与侵袭性代谢和DDR程序相关。离体神经球培养比肿瘤主体显示出更强的放射抵抗性和更慢的γH2AX解决。巨噬细胞来源的乳酸抑制cGAS-STING信号和抗肿瘤免疫，而乳酸转运抑制恢复免疫激活，将乳酸代谢与DDR信号和免疫逃逸联系起来。核胆固醇也通过控制癌干细胞中的核结构和DNA损伤反应参与DDR调节。高LET碳离子在GSCs中诱导复合的、缓慢修复的损伤，而分次放疗可富集CD133⁺ GSCs并促进线粒体生物发生和侵袭性。治疗上，IKCa/BKCa通道抑制放射致敏患者源性GSCs，而携带BiTE的溶瘤HSV-1利用DNA损伤诱导的NKG2DL表达放大免疫介导的杀伤。铁代谢也贡献于辐射反应异质性，因为铁蛋白重链调节改变胶质母细胞瘤起始细胞的敏感性。总之，这些研究表明代谢作为适应性DDR能力的允许层，使干细胞样胶质瘤细胞能够缓冲基因毒性应激并保持长期肿瘤传播能力。因此，靶向这些适应性代谢层为破坏治疗抵抗性GSC状态并增强放化疗疗效提供了有力途径。

靶向GSCs中DDR可塑性的治疗意义
上述多层DDR架构揭示了GSCs中几个可处理的治疗脆弱性。临床上，MGMT启动子甲基化仍是IDH野生型胶质母细胞瘤中对替莫唑胺反应的最强预测性生物标志物，在随机试验中预测烷化化疗的获益。相反，在IDH突变型胶质瘤中其预测价值有限，因为MGMT甲基化几乎普遍存在，不能可靠预测替莫唑胺获益。除MGMT外，复制应激和ATR-Chk1依赖性为联合使用ATR抑制剂（如ceralasertib或gartisertib）与放疗或替莫唑胺提供了理论依据，尤其是在MGMT甲基化肿瘤中，但某些药物如berzosertib的脑渗透性仍有限。PARP抑制，包括olaparib和talazoparib，在EGFR扩增的GSCs中显示出基因型选择性活性（其中EGFR诱导的氧化应激产生对PARP介导的BER的依赖），以及在MYC/MYCN扩增或IDH突变肿瘤中，后者赋予适合合成致死的“BRCAness”表型。RAD51和DNA-PKcs靶向方法也已进入临床评估；例如，DNA-PKcs抑制剂peposertib正在新诊断的MGMT非甲基化胶质母细胞瘤中进行临床评估（NCT04555577），具有良好的安全性和22.9个月的中位总生存期。然而，DDR抑制剂的放射致敏作用可能同时影响肿瘤和正常组织，使治疗窗优化成为核心问题。其他机会来自表观遗传和表观转录靶向。METTL3抑制尤为有吸引力，因为m⁶A依赖性调控支持HR修复、稳定SOX2，并增强MGMT/APNG表达，从而促进TMZ抵抗。LSD1抑制主要通过破坏ATF4依赖性整合应激反应来损害GSC维持，诱导分化和衰老，而非直接抑制DDR基因；而G9a抑制可损害HR和NHEJ修复并放射致敏胶质瘤细胞，尽管对干性的影响似乎背景依赖。包括PHGDH、SCD1和ALDH1A3在内的代谢依赖性也正在原位模型中进行评估，尽管GBM特异性临床试验仍有限。最后，通过mTOR和XPO1抑制的翻译控制已在临床上取得进展：selinexor已完成复发性GBM的II期试验（PFS6为17%），并正在与标准治疗联合评估（NCT04421378），尽管它可能悖论性地在MGMT非甲基化肿瘤中诱导MGMT表达并拮抗TMZ疗效。有效治疗很可能需要联合方案，同时靶向检查点成瘾（ATR/Chk1）、修复执行（RAD51/DNA-PK）和适应性生存程序（PI3K/Akt、表观遗传可塑性），并由分子DDR和代谢生物标志物指导，而非仅基于组织学。主要的可靶向轴、代表性化合物和候选选择标志物总结于表3。

讨论与结论
本文综述的文献支持一个框架，即HGGs中的治疗抵抗由多层可塑的DNA损伤反应维持。强化的检查点信号、复制应激耐受、动态DNA修复、表观遗传调控、翻译适应和代谢支持共同使GSC生存和复发得以实现。在此框架内，DNA损伤后转录活性的保持和恢复作为基因组维护的额外维度出现。这一观点特别相关，因为GSCs表现出升高的转录输出和长神经基因的优先表达，后者与持续的RNA聚合酶II占据相关。长基因易发生转录-复制冲突、R-loop积累和内源性复制应激，导致组成性DDR激活。在GSCs中，由长神经基因转录驱动的慢性复制应激已被直接关联到持久的ATR-Chk1信号和放射抵抗。在这种转录密集型状态下，转录能力与干性和应激适应紧密耦合。与此观点一致，关于高转录基因组结构域的机制研究表明转录活性本身塑造了修复优先级。对核糖体DNA的研究表明，转录耦合修复优先保留高度活跃基因座的转录，支持基因组维护中优先恢复转录而非全局损伤移除的层级。这些发现表明，在高转录需求的细胞中，细胞在DNA损伤后主动保护转录关键区域。近期胶质瘤研究进一步显示，电离辐射诱导P-TEFb依赖的RNA聚合酶II占据和延伸程序的快速重组，支持转录恢复作为积极的适应性反应，贡献于照射后生存。从化学角度，标准治疗诱导的DNA损伤是异质性的，产生具有不同结构后果的损伤。替莫唑胺主要形成N7-甲基鸟嘌呤和N3-甲基腺嘌呤加合物，以及无碱基位点。这些损伤是弱螺旋扭曲的，因此传统上被分配至BER。然而，烷基化碱基、无碱基位点和氧化核苷酸可以有效阻断转录链上的延伸RNA聚合酶II，与损伤块大小无关。因此，转录耦合修复在功能上由转录停滞而非损伤化学本身定义。电离辐射进一步强化了这一理论依据。除DSBs外，辐射还产生氧化碱基、簇状损伤和螺旋扭曲。许多这些损伤在DSB修复后仍干扰转录延伸。电离辐射后转录的恢复是活跃过程，在遗传上与DSB修复能力可分离。精通HR和NHEJ但转录耦合修复受损的细胞表现出持续转录停滞和放射敏感性，表明转录恢复代表一个独特的DDR结果。近期证据进一步将PHF8鉴定为DSB修复后转录恢复的促进因子，支持RNA聚合酶II活性的恢复作为调节性的损伤后过程。这些原则在胶质瘤干细胞中尤为相关。在GSCs中，当持续转录维持干性和适应性信号时，DNA损伤后转录的恢复可能代表关键优先事项。这一观点与以下观察一致：GSC抵抗依赖于损伤耐受和延长检查点参与而非完全损伤移除。尽管复制应激和转录可塑性是GSC生物学的既定特征，但转录相关修复和转录重启对治疗反应的贡献仍不完全清楚。近期工作已开始定义响应转录阻断损伤的转录重启的分子编排，鉴定出如XAB2等调节因子，其在转录重启过程中协调RNA聚合酶II释放和染色质重塑。未来研究应通过RNA聚合酶II占据分析、新生RNA标记和XAB2动态分析确定转录恢复是否功能上贡献于GSC治疗反应。还需确定转录恢复是否与HR程序和翻译依赖性修复因子可用性在机制上相关。在这方面，SPT6依赖性维持BRCA1和RAD51表达以及mTOR依赖性修复因子翻译表明，转录重启可能嵌入HR和翻译连接的生存回路中。综上所述，这些考虑表明，将转录相关修复和转录恢复整合到当前DDR框架中，可能提供胶质瘤干细胞如何承受治疗诱导损伤的更全面视图。尽管检查点成瘾、复制应激管理、HR、NHEJ、表观遗传调控、翻译控制和代谢重编程仍是核心抵抗机制，但转录恢复可能代表与HGG复发相关的基因组维护的额外功能终点。