《Nature Communications》：Structural basis of insulin receptor antagonism by bivalent site 1-site 2 ligands S961 and Ins-AC-S2
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先天性高胰岛素血症（Congenital Hyperinsulinism, HI）是一种罕见的遗传性疾病，其特征是胰岛素过度分泌。一类潜在的治疗方法是胰岛素受体拮抗剂，如S961和Ins-AC-S2，它们包含用于结合受体上两个胰岛素结合位点（位点1和位点2）的
先天性高胰岛素血症（Congenital Hyperinsulinism, HI）是一种罕见的遗传性疾病，其特征是胰岛素过度分泌。一类潜在的治疗方法是胰岛素受体拮抗剂，如S961和Ins-AC-S2，它们包含用于结合受体上两个胰岛素结合位点（位点1和位点2）的片段。值得注意的是，S597——包含与S961相同的受体结合片段但顺序相反（位点2-位点1）——是一种胰岛素受体激动剂而非拮抗剂。利用冷冻电镜（cryo-EM），研究人员展示了S961和Ins-AC-S2如何结合受体的非活性构象，从而解释了它们的拮抗作用。此外，研究人员的结构揭示了双价配体中位点1和位点2结合模块的顺序如何影响激动剂与拮抗剂活性。另外，研究人员展示了S961和Ins-AC-S2受体结合机制之间的细微差异，包括αCT（alpha C-terminal helix）的置换或结合，以及Ins-AC-S2胰岛素与受体FnIII-2/插入结构域（insert domains）之间的结合界面。这些结构见解可能为治疗先天性高胰岛素血症的下一代胰岛素受体拮抗剂的开发提供信息。
胰岛素受体（IR）拮抗剂治疗先天性高胰岛素血症（HI）的结构机制解读
先天性高胰岛素血症（HI）是一种罕见遗传病，发病率约1/25000–1/50000，由胰腺β细胞过度分泌胰岛素导致持续低血糖，若不治疗可引发癫痫、脑损伤甚至死亡。现有疗法靶向内源性胰岛素分泌通路，但疗效有限且副作用大，常需手术切除胰腺，进而导致1型糖尿病。因此，开发新型IR拮抗剂成为迫切需求。胰岛素通过结合IR胞外域上的位点1（由L1结构域和αCT螺旋组成）和位点2（FnIII-1结构域）激活受体，触发构象变化使细胞内酪氨酸激酶结构域靠近并自磷酸化。已知拮抗剂S961（43残基肽）和Ins-AC-S2（胰岛素衍生物）均包含位点1和位点2结合片段，但S961在低浓度下显示部分激动性和有丝分裂信号，而Ins-AC-S2则无部分激动性。值得注意的是，具有相同结合片段但顺序相反的S597是激动剂而非拮抗剂。研究人员为阐明拮抗机制，利用冷冻电镜（cryo-EM）解析了IR与S961和Ins-AC-S2的复合物结构，相关成果发表在《Nature Communications》。这些结构揭示了拮抗剂如何稳定非活性构象、结合位点顺序决定活性方向，以及Ins-AC-S2特有的受体-配体新界面，为开发高效HI治疗药物提供了结构基础。
研究人员主要采用以下关键技术方法：通过PiggyBac转座酶系统在HEK293细胞中稳定表达IR全长和胞外域（ECD）蛋白，经FLAG或Ni-NTA亲和层析及凝胶过滤纯化；与配体孵育后制备冷冻电镜样品，使用Titan Krios显微镜（Gatan K3相机）收集数据；利用CryoSPARC v4.7进行图像处理、3D分类及非均匀重构，分辨率达3.68??（IR/S961）和3.64??（ECD/Ins-AC-S2）；通过3D变异分析（3DVA）探索构象动态；结合细胞水平pAKT实验（NIH 3T3细胞过表达人IR-B）和等温滴定量热法（ITC）验证关键位点的功能意义。
研究结果如下：
1. **Structure of the IR/S961 complex**
通过冷冻电镜获得IR/S961复合物3.68??三维重构，发现受体呈现倒V形非活性构象（纤维蛋白茎间距约137??），两个配体分别结合两个受体半分子，化学计量比为1:2。图谱显示两个受体半分子分辨率显著不对称，其中一个半分子的FnIII-3结构域密度缺失，提示高度构象异质性。
2. **Ligand binding site organization and agonism vs. antagonism**
比较IR/S961与IR/S597（激动剂）结构发现：两者位点1和位点2结合片段与受体的相互作用方式相似，但S961的N端位点1位于膜近侧、位点2位于膜远侧，迫使L1与FnIII-1保持非活性相对位置；而S597的位点1平行于膜，允许L1上抬形成活性构象。因此，配体结合位点的顺序通过控制L1和FnIII-1的相对位置决定激动/拮抗活性。
3. **Conformational heterogeneity of the IR/S961 complex**
3DVA分析显示，受体一个臂的L1/CR模块可通过CR-L2铰链运动上下摆动。当L1/CR处于低位时，S961在位点1'密度强；当高位时密度弱。αCT与S961位点1螺旋竞争结合L1，导致S961从位点1'解离与受体动态耦合，这可能是S961低浓度部分激动性的结构基础。
4. **Structure of the ECD/Ins-AC-S2 complex**
解析ECD/Ins-AC-S2 3.64??结构，受体同样呈倒V形（纤维蛋白茎间距118??），但L1-L1'间距（100??）为apo受体（48??）的两倍，源于CR-L2铰链使L1远离茎部。Ins-AC-S2的胰岛素部分以经典方式结合位点1（与L1和αCT接触），位点2肽段结合FnIII-1。两个配体在受体半分子上位置略有不对称。
5. **Binding of Ins-AC-S2 to FnIII-2/ID stabilizes the antagonized receptor**
3DVA和局部细化发现，强纤维蛋白茎密度条件下，Ins-AC-S2胰岛素与相邻受体半分子的FnIII-2和插入结构域（ID）形成新界面，命名为site?1?。该界面包含A链9–15残基、B链N端1–5残基及FnIII-2/ID的13个残基，由电荷、极性及氢键稳定。突变实验显示，破坏site?1?的单突变体IC50增加1.4–3.5倍，六突变体IC50增加9.5倍，ITC结合亲和力降低36倍，证明site?1?贡献于拮抗活性和受体稳定性。该界面仅存在于非活性倒V构象中，为设计更强效拮抗剂提供了新靶点。
总结讨论部分：尽管IR/拮抗剂复合物均呈倒V构象，但S961与Ins-AC-S2有两个关键差异。第一，S961的位点1螺旋与αCT竞争结合L1，导致受体半分子不对称性，可能造成部分激动性；而Ins-AC-S2结合αCT，减少了构象异质性，稳定性更高。第二，Ins-AC-S2在非活性构象中形成site?1?界面（与FnIII-2/ID），补偿了配体结合时L1/CR上抬所破坏的apo状态L1-FnIII-2/ID相互作用。增强site?1?界面是开发下一代IR拮抗剂的有前景策略。
研究结论翻译：总之，IR拮抗剂是治疗HI的有前途的治疗方法，理解IR拮抗的结构原理对于开发下一代设计至关重要。尽管存在高度构象异质性显著复杂化了数据处理并阻碍了复合物的分辨率，研究人员确定了与两种拮抗剂S961和Ins-AC-S2结合的IR结构，两者均含有位点1-位点2结合片段组织。两种拮抗剂均以非活性倒V构象结合IR，解释了它们的拮抗作用。通过将S961/IR结构与先前报道的小鼠IR与S597（含有相同结合片段但顺序相反的肽）的结构进行比较，研究人员确定了这些配体的结合位点组织有助于IR L1结构域相对于相邻FnIII-1结构域的定位，进而决定受体的整体构象。这些发现为这些配体的肽结合位点组织与受体活性之间的关系提供了解释。有趣的是，研究人员的结构并未解释S961在低浓度下报道的部分激动性，这可能是影响IR配体活性的其他因素所致。
