《Nature Communications》：Structural insights into YheS-mediated release of SecM-arrested ribosome
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ATP结合盒亚家族F（ABCF）蛋白与核糖体相互作用，以解决肽基转移酶中心（PTC）附近的翻译缺陷。在大肠杆菌（Escherichia coli）中，四种ABCF蛋白（EttA、Uup、YbiT和YheS）选择性促进不同问题性新生肽序列的翻译，但其分子机制仍不
ATP结合盒亚家族F（ABCF）蛋白与核糖体相互作用，以解决肽基转移酶中心（PTC）附近的翻译缺陷。在大肠杆菌（Escherichia coli）中，四种ABCF蛋白（EttA、Uup、YbiT和YheS）选择性促进不同问题性新生肽序列的翻译，但其分子机制仍不清楚。在此，研究人员展示了核糖体与YheS的ATP酶缺陷突变体复合物的2.8??冷冻电镜（cryo-EM）结构，并研究了它如何释放被SecM新生链停滞的核糖体。YheS通过L1柄结合到核糖体E位点，其P位点tRNA相互作用基序（PtIM）向PTC延伸，置换P位点tRNA的CCA末端。值得注意的是，对应出口通道内SecM新生链的cryo-EM密度在YheS结合后大部分消失。这些观察表明，YheS通过P位点tRNA重排扰动新生链-通道相互作用，从而缓解肽序列依赖的停滞。受控分子动力学模拟为该模型提供了定性支持。总之，研究人员的发现为一种不同于易位子介导释放机制的停滞释放模式提供了机制性见解。
论文解读文章
**研究背景**
蛋白质序列的多样性赋予了蛋白质功能复杂性，但核糖体在聚合某些氨基酸序列（如脯氨酸、色氨酸、带电残基的连续序列或核糖体停滞肽）时存在困难，这些问题源于新生肽链在出口通道内的相互作用。全基因组和结构研究表明，此类问题序列广泛存在，并在应激或衰老条件下更具危害性。细胞进化出了利用此类困难事件进行基因调控的能力。在大肠杆菌中，SecM新生多肽链通过与出口通道的相互作用使核糖体停滞，从而促进下游转位酶SecA的表达。停滞的核糖体随后被Sec易位子产生的外部拉力释放，这代表了程序化翻译停滞的一种机械策略。为降低此类问题序列的风险，细胞还进化出了专门的翻译因子，如EF-P（真核生物中的eIF5A），它通过结合核糖体E位点缓解聚脯氨酸段处的停滞。此外，ABCF（ATP结合盒亚家族F）家族的成员已被发现是翻译困难的额外调节因子。其中，抗生素耐药性（ARE）ABCF通过插入一个长结构域间连接子（约110 aa）来置换出口通道中的抗生素，该连接子将P位点tRNA（P-tRNA）重新定位。相比之下，非ARE ABCF（包括大肠杆菌中的EttA、Uup、YbiT和YheS）具有较短的结构域间连接子（约80 aa），称为P-tRNA相互作用基序（PtIM）。尽管EttA促进起始后的延伸，但其他非ARE ABCF的功能仍不清楚。近期研究表明，这四种ABCF管理“难以翻译”的氨基酸序列，它们表现出“序列特异性”，针对不同的困难基序。例如，YheS特异性地释放SecM停滞的核糖体，但其他ABCF不能。尽管预测的结构相似，但YheS特异性释放SecM诱导翻译停滞的分子基础仍然未知。因此，本研究旨在探讨YheS缓解SecM诱导核糖体停滞的机制。
**研究概述与意义**
研究人员利用单粒子冷冻电镜（cryo-EM），结合分子动力学（MD）模拟，解析了YheS与SecM停滞核糖体复合物的结构。通过使用YheS的ATP酶缺陷突变体（EQ2）防止其解离，获得了分辨率为2.82??的结构。YheS占据核糖体E位点，其PtIM向肽基转移酶中心（PTC）突出，与50S大亚基（LSU）形成广泛接触，并重新定位P-tRNA，伴随SecM新生链约2??的缩回。这些结构发现，结合MD模拟的支持，表明YheS通过一种不同于Sec易位子介导释放的机制促进SecM停滞核糖体的释放。该论文发表在《Nature Communications》。
**主要关键技术方法**
本研究采用单粒子冷冻电镜（cryo-EM）技术解析核糖体复合物结构，并通过受控分子动力学（SMD）模拟进行机制验证。具体包括：使用PUREfrex v1.0进行体外偶联转录-翻译反应，重构SecM停滞核糖体；纯化YheS及ATP酶缺陷突变体（YheS-EQ2）；在Quantifoil Au 300目载网上制备冷冻样品；利用Titan Krios G4显微镜配备K3探测器采集cryo-EM数据；使用cryoSPARC和RELION进行图像处理与三维重构；使用Amber 24软件进行SMD模拟。样本队列来源于体外重组系统，未涉及特定临床队列。
**研究结果**
**1. YheS结合SecM停滞核糖体复合物的整体结构**
研究人员通过cryo-EM确定了YheS与SecM停滞核糖体的复合物结构，分辨率为2.82??。YheS结合于核糖体E位点，与23S rRNA、L1柄、30S小亚基（SSU）头部的uS7蛋白以及P-tRNA相互作用。出口通道内仅可见SecM新生链C端三个残基（Arg163-Ala164-Gly165），上游片段密度缺失，表明YheS结合后新生链-通道相互作用减弱。
**2. YheS中的ATP相互作用**
YheS在两个核苷酸结合域（NBD1和NBD2）的P环上结合两个ATP分子（ATP1和ATP2）。ATP结合位点位于NBD1与NBD2界面，γ-磷酸介导的结构域间相互作用提示ATP水解会破坏该界面，导致YheS构象变化并解离。
**3. Arm亚结构域与LSU L1柄的相互作用**
YheS的Arm亚结构域与L1柄中的蛋白uL1及23S rRNA的螺旋76（H76）形成氢键和堆叠相互作用，稳定了通常柔性的L1柄，使其在cryo-EM图中清晰可见。
**4. 与SSU头部和LSU中央突起的相互作用**
YheS的NBD1与SSU头部的核糖体蛋白uS7形成氢键或盐桥，诱导SSU头部约6??的位移，扩大了E位点空间。YheS也与LSU中央突起（CP）相互作用，使其位移约5??，该位移与P-tRNA重排相关。
**5. PtIM与23S rRNA的相互作用**
PtIM尖端十个残基与23S rRNA域V的螺旋74、75、80和93形成氢键或盐桥，将PtIM牢固锚定于LSU，并定义其相对于PTC的位置。PTC附近的核苷酸（如A2062、U2506、U2585、A2602）发生构象变化。
**6. P-tRNA相互作用与重排**
YheS的NBD2与P-tRNA肘部区域相互作用（如Gln408与C56形成氢键，Arg411与碱基堆叠），PtIM尖端与P-tRNA的3′端（U73、C74）形成盐桥和氢键。相比无YheS的停滞核糖体，P-tRNA接纳臂位移5-12??，肘部旋转约25°，破坏了P-tRNA与23S rRNA之间的碱基配对。
**7. SecM新生链重排**
P-tRNA重排导致其3′末端A76向远离PTC方向位移2.2??，机械地耦合至SecM新生链。C端三个残基Cα原子位移1.1-1.7??，Arg163侧链构象改变。A位点Pro166的氨基与Ala164羰基及P-tRNA A76的3′-OH之间的氢键距离延长至3.7和4.5??，超过典型氢键距离，表明停滞相关相互作用减弱，但Pro166氨基仍远离催化几何所需位置（5.5??），提示YheS解离后才恢复催化构型。
**8. YheS与核糖体及tRNA相互作用的突变分析**
通过点突变引入YheS与核糖体或P-tRNA相互作用的关键残基，测定其释放活性。破坏Arm-uL1相互作用（D118A、W123A）或PtIM与PTC附近23S rRNA相互作用（R279A）的突变导致活性降低50%以上；多重突变株缺陷更严重。而破坏与远端23S rRNA或uS7相互作用的突变影响较小，表明直接接触L1柄蛋白和PTC附近23S rRNA对YheS功能至关重要。破坏P-tRNA相互作用的突变仅产生轻微影响，说明这些相互作用是辅助性的。
**9. 分子模拟中P-tRNA重排期间SecM的行为**
研究人员构建了包含SecM残基149-165及周围23S rRNA片段的缩减模型，施加近似于cryo-EM观察到的延伸进行SMD模拟。模拟显示，在α-螺旋区域未观察到明显构象失稳，但多个残基间距离和二面角发生改变（如Ile156–Ile162、Arg163–Ψ2504），这些接触此前被证实与SecM停滞相关，定性支持P-tRNA重排可削弱关键肽-通道相互作用。
**10. 与其他ABCF蛋白的比较**
ARE ABCF具有长PtIM，延伸至PTC甚至出口通道，直接置换抗生素；非ARE ABCF如EttA具有短PtIM，仅引起轻微P-tRNA位移或稳定P-tRNA。YheS尽管PtIM短，但通过PtIM与23S rRNA的广泛接触及与tRNA肘部的相互作用，实现了类似ARE ABCF的显著P-tRNA重排，这可能是其独特机制。
**总结与讨论**
研究人员提出了YheS介导释放的模型：识别（YheS通过L1柄结合空E位点）→插入（PtIM重排P-tRNA并与23S rRNA形成稳定接触）→扰动（P-tRNA重排导致SecM新生链移位，削弱关键停滞相关相互作用，包括Ala164-Pro166几何及通道接触）→解离（ATP水解触发YheS构象变化，促进解离，使肽基转移恢复）。该模型解释了YheS对其他停滞肽（如ApdP的RAPP基序）无效的原因，因其更依赖PTC近端残基而较少依赖远端通道接触。YheS的作用不同于EF-P或EttA通过稳定P-tRNA促进延伸，也不同于ARE ABCF直接置换抗生素，凸显了ABCF蛋白通过专门机制解决多样化翻译缺陷的能力。研究结果为理解YheS解决SecM诱导停滞提供了结构框架，并证明了在停滞解析中机械策略的多样性。
