加拿大育空地区永冻土保存的地松鼠粪便(coprolite)封存可追溯至70万年前以上的复杂古环境DNA(ancient environmental DNA, aeDNA)档案

《Nature Communications》：Ground squirrel coprolites preserve complex archives of ancient environmental DNA over 700,000 years

　　

研究人员利用shotgun宏基因组学(metagenomics)及靶向富集(targeted enrichment)技术，对采自加拿大育空(Yukon)永冻土中北极地松鼠属(Urocitellus)洞穴内保存的更新世至全新世粪化石(coprolite/palaeofaeces，时间跨度可达中更新世～700?kya)进行分析，从中恢复出丰富的多分类群古环境DNA(ancient environmental DNA, aeDNA)，包括植物、昆虫、微生物及符合东部白令陆桥(Beringia)生态系统的巨型动物。这些coprolite稳定保存大量真核生物DNA，使研究人员得以组装>18个线粒体基因组(地松鼠、雪鞋野兔snowshoe hare、草原野牛steppe bison、马horse及猛犸象woolly mammoth)，并揭示北极Urocitellus此前未被认知的多样性——含一支约70万年前谱系，其分歧早于若干现存分支分化。特征性损伤模式、阳/阴性对照及计算机(in silico)分类学验证强有力支持古代DNA(aDNA)真实性；与区域永冻土数据集比对表明沉积后浸出(leaching)极微。结果表明：永冻土coprolite可提供第四纪生态系统高分辨率记录及多物种种群历史，是沉积物及骨骼aDNA的有力补充。

研究背景与意义

第四纪(Qaternary)冰期—间冰期旋回中白令陆桥(Beringia, 东段为育空与阿拉斯加)生态系统演替及巨型动物群(megafauna)消亡机制是古气候与进化生物学核心议题。传统古生态重建依赖骨骼、牙齿、孢粉及湖泊沉积物中的古环境DNA(sedimentary ancient environmental DNA, sedaDNA)，但骨骼仅含宿主信息，沉积物易受外来DNA污染且真核aeDNA保存率偏低。粪化石(coprolite/palaeofaeces)作为"时间封存的生物快照"可同时保存排遗者(host)、食物(diet)、肠道微生物(gut microbiome)及周边环境DNA，理论上可兼顾多分类群信息与宿主时间标定，但因富含腐殖酸(humic acids)、酚类及DNA交联(cross-linking)导致PCR抑制严重，加之分类鉴定困难，长期未被系统开发为aeDNA常规载体。加拿大育空未冰川作用区北极地松鼠(Urocitellus parryii)筑洞于永冻土，洞穴内粪丸(faecal pellets)与食物储藏室(midden)可被原位冻结密封数十万年，具备成为第四纪aeDNA档案库的独特行为—生理适应性。本研究旨在评估永冻土地松鼠coprolite跨时间尺度对多分类群aeDNA的保存能力，并利用其重建东Beringia第四纪生态系统组成与地松鼠种群历史。该研究成果发表于《Nature Communications》。

主要关键技术方法

研究人员采集育空克朗代克(Klondike)地区北极地松鼠midden中13份更新世coprolite（MIS 1–4及MIS 16/18中～700?kya Gold Run火山灰关联样本）与1份全新世非松鼠源coprolite对照；年代框架由¹⁴C测年及火山灰层(tephrochronology：Gold Run/Dawson/Sheep Creek Klondike tephra)确定。关键实验流程含：(1)低温离心冷沉法(cold spin)结合大体积高盐结合缓冲液从≤0.1?g粪丸提取aDNA并克服PCR抑制；(2)双链(dsLib)与单链(ssLib)文库构建，部分经尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)处理；(3)使用PalaeoChip Arctic-1.0 bait-set（动物mtDNA + 植物cpDNA trnL/matK/rbcL）及松鼠Xerinae定制baits进行液相杂交捕获富集(targeted capture enrichment)；(4)宏基因组分类采用先比对至区域器官ellar参考库过滤后BLASTn比对NCBI-NT再用MEGAN7最低共同祖先(LCA)严格参数，辅以holi/metaDMG评估aDNA损伤特征；(5)>18个线粒体基因组的de novo（SPAdes）与基于参考(reference-based, endoCaller/Schmutzi)组装及系统发育分析（RAxML ML树与BEAST松弛分子钟贝叶斯树）；(6)宏观化石(macrofossil)分选鉴定与aDNA信号互证；(7)多批次提取/建库阴性对照与阳性(Holocene snowshoe hare coprolite)对照监控污染。

研究结果(Results and discussion)

Summary of results

经提取优化克服腐殖酸抑制后获高质量aeDNA文库。宏基因组分类检出排遗者、食物(植物/小型动物)、肠道及环境真核/原核/无脊椎类群。从coprolite组装>18条线粒体基因组，其中地松鼠(n=12)、雪鞋野兔(n=1)、草原野牛(n=2)、马(n=3)；系统发育提示育空地松鼠含两未描述种群。阴性对照无非特异信号，aDNA具典型末端脱氨基(C→T/G→A)与短片段(<50?bp)，证实古老性；与全新世对照及区域沉积物比显示coprolite真核aeDNA单位质量回收率超骨骼与沉积样。

Geological setting and chronology

最老样本(SC-14)赋存于Gold Run tephra之下（688±44?kya，MIS 16c/18a），其余MIS 1–4（LGM至冰后期过渡）。伴生 macrofossil与动物残骸指示干冷灌木冻原—猛犸草原(mammoth-steppe)环境。

Macrofossils

11份样本分拣出45类宏体化石(植物25类定至属种，动物类2目)，各样本组合独特，与aeDNA植物/昆虫分类相互印证。

Metagenomics: coprolite aeDNA

动物aeDNA以Marmotini→Urocitellus为主，检出猛犸象(Mammuthus primigenius)、草原野牛(Bison priscus)、马(Equus)、披毛兔(Lepus americanus 全新世对照独有)等；植物aeDNA在更新世样中以禾草(Poaceae)、杂类草(forbs)为主（Plantago, Artemisia, Carex等），全新世样以木本(Betula, Picea, Alnus)为主。微生物群落主成分分析(PCoA)显示coprolite与周边沉积微生物显著分离，表明极少沉积后DNA浸出。无脊椎类(甲虫、蝗虫等)aeDNA与midden中宏化石吻合。

Genome assembly and phylogenetics

—Urocitellus：所有地松鼠coprolite成功组装mt基因组，MIS 4–2个体聚为区别于现存U. parryii及U. richardsonii的独立支系（cyt-b基因树支持～421?kya分化）；700?kya样本(SC-14)mt基因组位于北极Urocitellus基部，姊妹群为现生U. undulatus（～1.1?mya分歧），代表未描述的中更新世Urocitellus谱系。

—Equus：三例马mt基因组落入北美caballine/Equus lambei分支，与区域骨及sedaDNA一致。

—Bison：两例草原野牛mt基因组落于北美B. priscus支。

Thermal age

脱氨与脱嘌呤程度与样本年龄及GISP2 δ¹⁸O古温度代理呈相关性。

Authentication

13批次阴性对照无非靶真核信号（零星Homo为现代污染），全新世对照仅含预期boreal物种及雪鞋野兔强信号，无更新世特有类群；所有可组装mt基因组具典型aDNA损伤模式（末端微笑smile pattern及<50?bp片段）；in silico模拟验证MEGAN分类假阳性率低；macrofossil独立佐证分类。综合确认aeDNA源自coprolite本身，非现代或跨样本污染。

aDNA from bones, sediments, and coprolites

归一化单位起始量后，coprolite中靶标(on-target)动植物细胞器DNA比例显著高于同区永冻土沉积物与骨骼；骨骼仅含单一宿主DNA而coprolite与沉积物具高分类多样性。证明coprolite aeDNA保存优于或等同于其他永冻土介质。

The evolutionary history of Beringian ground squirrels

现生U. parryii应非单系群(paraphyletic)，育空更新世coprolite assembled mt基因组代表历史上分布于育空但在现生分类中未被识别的Urocitellus种群（或隐存种），MIS 4与MIS 2样本mt基因组连续暗示MIS 3存在局部避难所(refugium)。700?kya标本为已知最老粪化石来源mt基因组之一，校准分子钟得北方与南方Urocitellus ～1.5?mya分化。

Diet versus exogenous midden leaching

coprolite微生物组显著异于同层沉积物且混入样(SC-15)呈过渡态，表明极少外源sedaDNA渗入；部分大型动物aeDNA可能源于midden储存组织或食性摄入。宏化石中啮齿类、蝗虫等与aeDNA吻合支持部分为食性来源。

Palaeoecology through the lens of squirrel faeces

coprolite aeDNA重建的MIS 4–2 flora/fauna组合与区域mammoth-steppe sedaDNA一致，全新世样标志北方森林(boreal forest)转型（～13?kya B?lling–Aller?d），证实coprolite忠实记录第四纪生态演替。

Authenticity and caveats

局限含多粒粪丸混合匀浆未做单粒内/外表层分离、mt基因组可能来自多个体、极少数低读长非本地分类单元(Whippomorpha等)判为算法/数据库偏差假阳性，均已标注。整体经多层验证确保主体数据可靠。

讨论与结论翻译

永冻土地松鼠coprolite是可提供跨冰期—间冰期多分类群aeDNA的高价值档案，保存排遗者(host)、肠道微生物及同期生态环境多样信号，部分情形下信息量超过骨骼与沉积物。经严格验证流程证实其可重建Beringia古生态及系统发生有意义之mt基因组（含中更新世地松鼠谱系）。Coprolite不仅封存宿主及其肠道菌群aDNA，亦广域捕获同时代共存生物信息。育空地区已发现数百处此类midden，对其aeDNA分析有望精细解析中—晚更新世生态动态，并以火山灰定年的midden校准分子钟，为众多第四纪谱系系统基因组学提供地层约束，获得史无前例的演化、适应与灭绝洞察。